传统热补针法对实验性关节炎家兔外周镇痛机理的研究

                作者：刘世琼,秦晓光,杜小正,骆文郁  

　摘 要:目的：观察传统热补针法对实验性关节炎家兔模型的镇痛效应和外周镇痛机理。方法：将健康的2～3月龄青紫蓝家兔50只在测定痛阈后，按随机表分组法分为正常对照组、模型对照组、内服药物对照组、捻转针法对照组、热补针法组5组，每组9只。以卵蛋白诱导关节炎疼痛模型。对正常对照组、模型对照组家兔每天进行抓取、固定刺激，其余3组进行连续治疗。6 d后，比较各组家兔膝关节组织中β内啡肽（βEP）、亮啡肽（LEK）、前列腺素E2（PGE2）含量的变化。结果：经治疗后，各治疗组家兔在痛阈提高的同时，膝关节组织中的PGE2、βEP、LEK含量有明显改变。其中热补针法组膝关节组织中的PGE2显著降低，βEP、LEK显著升高，其作用优于内服药物组和捻转针法组（P<0.05或P<0.01）。结论：传统热补针法有显著的外周镇痛效应。

　　关键词:关节炎；热补针法；外周镇痛机理

　　1材料与方法

　　1.1   动物选择

　　选择健康的2～3月龄青紫蓝兔５0只，体重2.5±0.5 kg，雌雄各半，由卫生部兰州生物制品研究所实验动物中心提供。合格证号：2004-018。动物在实验前适应性饲养1周并进行动物痛阈测定以进行筛选。其标准是：痛阈在1.80 mA左右，能引起缩腿反应的应用于实验，少于1.30 mA或大于2.30 mA者，表示动物反应过敏或迟钝，弃之不用。

　　1.2实验方法

　　1.2.1动物分组

　　实验开始前，将动物适应性喂养7 d，然后按随机数字表分组法将动物随机分为正常对照组、模型对照组、内服药物对照组、捻转针法对照组、热补针法治疗组５组，每组9只。

　　1.2.2  动物模型的复制

　　除空白对照组外，其他各组均进行造模。造模方法参照有关〔1〕。于实验正式开始前3 d用脱毛剂脱去家兔的双后腿膝关节周围和背部肩胛骨间的毛。将4 mg/mL的卵蛋白溶液与等量弗氏完全佐剂（CFA）混匀，充分震荡成乳化剂。在肩、背部选6个点，每点皮下注射该溶液0.2 mL。14 d后以相同剂量重复皮下注射1次。第二次免疫后6 d，在家兔的双膝关节分别注入20 mg/mL卵蛋白生理盐水溶液0.4 mL。观察到家兔精神委靡、懒于活动，关节肿胀、行动缓慢、双膝关节肿胀为造模成功。

　　1.2.3选取穴位

　　根据临床经验并考虑到实验可行，选取双侧合谷、足三里穴。穴位的定位，参照《实验针灸学》“家兔常用针灸穴位定位标准”而定。合谷在前腿掌背侧第1、2掌骨间，约相当第2掌骨中点桡侧；足三里在小腿背外侧上1/5折点处，约相当腓骨头下1.2 cm、胫骨嵴后1 cm处。

　　1.2.4处理方法

　　A、正常对照组：不造模，从实验第27 d开始，每天用与其他治疗组的相同方法刺激、固定1次，每次30 min，连续6 d。

　　B、模型对照组：造模成功后，从实验第27 d开始，每天用与其他治疗组的相同方法刺激、固定1次，每次30 min，连续6 d。

　　C、内服药物对照组：造模成功后，从实验第27 d开始喂服痹冲剂，0.56 g/次（按体表面积折算的等效计量，相当于人体常规用量的4.9倍），用蒸馏水按1∶5的比例调成水糊状进行灌胃，3次/d，连续6 d。

　　D、捻转针法对照组：造模成功后，从实验第27 d开始，每天施“捻转”针法1次。其方法是先将家兔用改良后兔台固定，选取后腿的“足三里”和前腿的“合谷”穴。将针刺入穴内0.8～1.2 cm，施以前后捻转的手法，做到指力均匀、角度适当（180°～360°），不做单向捻转，每穴操作1 min，留针30 min。连续治疗6 d。

　　E、热补针法治疗组：造模成功后，从实验第27 d开始，每天施“热补”针法治疗1次。其方法在固定及选穴上同捻转组。左手食指或拇指紧按穴位，右手将针刺入穴位0.8～1.2 cm，候其气至，左手加重压力，右手拇指向前连续捻转5次，候针下沉紧，针尖拉着有感应的部位，连续重按轻提5次；拇指再连续地向前捻、按5次，然后针尖顶着产生感觉的部位守气，使针下继续沉紧，之后留针30 min。连续治疗6 d。

　　1.2.5观察指标及检测方法

　　1.2.5.1  痛阈

　　在治疗6次后的第2 d测痛阈。检测方法参照有关〔3〕，在右膝关节表面安装含有饱和氯化钾溶液的电极，无关电极接在右前肢，两极与WQ-9E测痛仪相连，用电流强度线型递增的直流电将K+导入皮肤作痛刺激。以右后腿的收缩性反应作痛指标，以能引起家兔后腿收缩的最小电流强度作为痛阈。前、后共测量3次，每次之间间隔5 min，取其平均值作为痛阈。

　　1.2.5.2   膝关节局部的βEP、LEK

　　测定痛阈后，将各组家兔经耳缘静脉注射25 %乌拉坦8 mL麻醉。取膝关节周围带皮组织，迅速置沸腾生理盐水中煮沸5 min，用滤纸吸去水分；准确称取200 mg。然后移至玻璃匀浆器中，加入1 mol/L的HAc溶液2 mL，再将匀浆器置于0 ℃冰水浴中匀浆15 min，静置2 h；再加入1 mol/L的NaOH溶液2 mL，振荡均匀后将匀浆液移至低温离心管中；经4000 r/min、-4０C低温离心20 min，取上清液2 mL，置于-20 ℃低温冰箱冷冻保存待测。采用放免法测定βEP、LEK含量。检测方法参照药盒所附说明书,由兰州大学第一核医学科测定。

　　1.2.5.3  膝关节局部的PGE2

　　测定痛阈后，将各组家兔经耳缘静脉注射25 %乌拉坦8 mL麻醉。取膝关节周围带皮组织，用滤纸吸去血渍；准确称取200 mg。然后移至玻璃匀浆器中，加入无水乙醇1 mL，再将匀浆器置于0 ℃冰水浴中匀浆15 min，静置2 h；然后加入生理盐水3 mL，振荡均匀后，将匀浆液移置低温离心管中；经4000 r/min、-4 ℃低温离心20 min，取上清液2 mL，置于-20 ℃低温冰箱冷冻保存待测。采用放免法测定PGE2含量。检测方法参照药盒所附说明书,由兰州大学第一医院核医学科测定。

　　1.3实验数据的统计方法

　　实验数据均采用均数±标准差(±s)表示。各组间均数比较用单因素方差分析(one-way ANOVA)。组间均数的两两比较，方差齐时选择S-N-K法；方差不齐时选择Dunnett T3法。所有统计均用SPSS 13.0软件分析。

　　2实验结果

　　2.1热补针法对家兔关节局部痛阈的影响见表1 注:与正常组比较*P<0.05,**P<0.01；与模型组比较□□P<0.01从表1得知:模型组的痛阈明显低于正常组,有非常显著性差异(P<0.01);经治疗后各治疗组家兔的痛阈均有升高，与模型组相比,各治疗组均有非常显著性差异(P<0.01)；与正常组比较，药物组有非常显著性差异 (P<0.01);热补组和捻转组有显著性差异(P<0.05);说明热补针法能明显提高痛阈，有很好的止痛作用。

　　2．2热补针法对家兔膝关节组织中βEP、LEK的影响见表2。表2热补针法对家兔膝关节组织从表2得知:模型组外周组织中βEP、LEK含量显著高于正常组（P<0.05），说明关节炎本身可升高外周组织中βEP及LEK含量；经过治疗后，与模型组相比，捻转对照组、药物对照组、热补治疗组外周组织中βEP、LEK含量均有显著性升高（P<0.05或P<0.01）；与捻转对照组和药物对照组比较，热补治疗组βEP及LEK含量升高有非常显著性差异（P<0.01）。进一步说明热补法有很好的外周镇痛作用。

　　2．3热补针法对家兔膝关节组织中PGE2含量的影响见表3。表3热补针法对家兔膝关节组织中注:与正常组比较P<0.05,**P<0.01；与模型组比较□P<0.05,□□P<0.01;与热补组比较▲P<0.05从表3得知:模型组外周组织中PGE2含量高于正常组（P<0.01），说明关节炎本身可升高外周组织中PGE2含量；经过治疗后，与模型组比较，捻转组、药物组的PGE2含量降低（P<0.05），热补针法组的PGE2含量显著性降低（P<0.01）；与捻转针法组和药物组比较，热补针法组PGE2含量降低有显著差异（P<0.05）。更进一步说明热补针法有很好的外周镇痛作用。

　　3 讨论

　　内源性阿片肽（EOP）以βEP、LEK等为代表。当机体受到伤害性刺激后，脑内的EOP合成和释放增加，部分通过垂体门脉系统释放入血。βEP被认为是一种应急指标〔2〕。EOP发挥外周镇痛作用的一个首要条件是局部炎症的存在，并且与组织痛敏、伤害性刺激传入增多相伴行。炎症时，运转阿片受体到外周的轴浆流增多，神经末梢内阿片受体数目也相应增多。关节炎疼痛状态时，作用于阿片受体的内阿片肽（包括βEP、脑啡肽等）的主要来源为炎症组织中的免疫细胞（如T细胞、B细胞、单核细胞、肥大细胞等）。尚有研究表明〔3〕，针刺通过刺激外周阿片释放而发挥免疫调控作用，βEP可增强单核细胞的趋化性，使NK细胞活化增强，一些细胞因子和促皮质激素释放因子等可能介导了这些内阿片肽的释放。本实验研究结果表明，模型组家兔膝关节βEP、LEK含量高于正常组（P<0.05），与陈志武等的研究结果相一致；经治疗后，捻转针法组、药物组外周组织中βEP含量显著升高（P<0.05），热补针法组非常显著性升高（P<0.01）；与捻转针法组和药物组比较，热补针法组的βEP、LEK含量升高有非常显著性差异（P<0.01）。其机理可能是热补针法增强了家兔脾细胞IL1、IL2活性，促进中枢及炎症局部淋巴细胞内前阿黑皮素(POMC)和前脑啡肽(PENK)的表达，继而使对机体有镇痛作用的内源性阿片肽βEP、LEK的合成和释放增加〔4〕。从而说明热补针法可以通过调整机体免疫机能，增加内源性阿片肽的释放而达到外周镇痛作用。

　　PGE2是在致炎因子作用下局部组织产生和释放的具有致炎致痛作用的炎症介质。PGE2可引起局部血管通透性增加，产生水肿、红斑、发热，激活或致敏伤害性感受器而产生疼痛过敏〔1〕，从而发动和传递痛觉信号。有报道证实，针刺可降低炎症局部的组织胺、PGE2、5HT等物质，提高炎症局部βEP含量，抑制痛觉感受器对痛觉刺激的敏感性，减少外周神经系统传递痛觉信号，提高痛阈，达到镇痛的目的。本实验观察到模型组家兔致敏后，外周组织中的PGE2含量明显升高，与正常组比较，有非常显著性差异（P<0.01）。提示PGE2在发病机制中发挥了重要作用。经治疗后，各治疗组的PGE2含量都有不同程度的降低。与捻转针法组和内服药物组比较，热补针法组PGE2含量降低有显著差异（P<0.05）。这可能是热补针法通过增强和调节了全身的免疫功能而达到抗炎镇痛的目的。

　　文献:

　　〔1〕Tominaga K,Alstergren P,Kurita H,et al.Cinical course of antigeninduced arthritis model in the rabbit temporomandibular joint[J]. Oral patholmed,1999,28:268-173.

　　〔2〕蓝敏.半导体激光对兔骨折后痛阈的影响[J].江苏大学学报（医学版），2003，13（2）：160.

　　〔3〕陈志武.阿片外周镇痛作用及其机制[J].药通报，1998，14（3）：285.

　　〔4〕赵仓焕.电针对佐剂性关节炎大鼠脾细胞IL1、IL2活性的影响[J].上海针灸杂志，2000，19（增刊）：61.