骨组织形态计量学在骨折愈合实验研究中的应用
关键词：骨组织形态计量学；骨折愈合；实验研究
1 引言
骨组织形态计量学（Bone histomorphometry），是对骨组织进行定量描述的一门技术，目前主要通过对显微镜下骨组织二维平面的测量，根据体视学原理，推测或转换获得三维参数〔1〕。其基本原理为Cavalieri原理和Delesse原理。Cavalieri原理由17世纪意大利数学家Cavalieri提出，其含义是将物体等距做数个切面，各切面的面积之和（∑a）与切面之间距离（d）的乘积，即可求得物体的绝对体积，用公式表示为：V=∑a・d。Delesse原理由19世纪法国地质学家Delesse提出，是最基本、最简单、最实用的原理之一，用它可求得面积分数（面积密度AA）和体积分数（体积密度VV），用公式表示为：AA=∑A/∑AO=VV（∑A为切面内特征物面积之和，∑AO为切面内参照面积之和）。体视学在材料学、地质学中开展较早，称“定量金相”。1968年，国际体视学会成立，开始并迅速普遍用于生物医学领域。通过1973年3月（加拿大）、1976年3月（法国）、1980年3月（美国）3次骨组织测量学国际学术会的召开，为该方法在骨科领域的应用打下了基础〔2〕。1988年，体视学学会和中国生物医学体视学会正式成立，体视学的方法开始在国内得到推广和应用。因此，骨组织计量学用于骨科在国内仅10余年时间。目前应用最多的是用于骨质疏松的研究，而在骨折愈合中则较少，二者尽管有许多相同的地方，却也存在明显不同，对此尚需进一步探讨。
2 主要技术步骤
根据我们的经验，其主要技术步骤为标本制备→采图→测量→转换为参数→结论。
2．1 标本制备
实验动物选家兔比大鼠好，因其更易制作硬切片。涉及到四环素标记、取材、固定、脱水、包埋、制片、染色等步骤。
2.1.1 四环素标记
若要获得动态参数，需对动物行四环素族药物活体标记，如四环素、土霉素、金霉素口服或肌注均可，目的是了解骨矿化动态过程。进行双标时为获得可靠标记结果，每次标记最好连续2天，末次标记在取材前2～3天，2次标记间隔时间兔以6天为最佳。如第4、5天行第一次标记，则第11、12天行第二次标记。
2.1.2 取材
一般在兔桡骨中段造成3 mm宽缺损后，以该处为中心共取2 cm长桡骨标本。动作要轻柔，以防再次骨折影响结果的准确性。
2.1.3 固定
一般采用10 %的福尔马林缓冲液（pH 7.0～7.1）或70 %乙醇或100 %乙醇固定3天。对于四环素标记的标本以乙醇固定为好，福尔马林溶液可使标记的颜色减退。
2.1.4 脱水
用酒精从低浓度到高浓度梯度脱水，若采用80 %的固定浓度则勿需脱水。
2.1.5 包埋
包埋剂一般用甲基丙烯酸甲酯和邻苯二甲酸二丁酯，临用时以3 ∶1比例混合，加过氧化苯甲酯适量，可起催化作用。包埋过程中注意负压抽气，防止气泡形成。
2.1.6 制片
传统对骨组织形态结构的观察，一般多用硬骨磨片和脱钙后切片。这些方法各有其不如人意之处，如：硬骨磨片易破裂、不完整；脱钙后切片易变形、失真，使骨组织很重要的成分矿物质丢失。目前，在骨组织的形态计量学研究中，学者们都认为采用锯片后磨片和不脱钙切片较为理想〔3〕。但我们认为，锯片后磨片费时、费力，过程复杂，一般研究人员难以掌握，其片子厚度也较厚，约为20～30 μm，由于投影过多、投影过少、截尾效应将影响部分数据的观察；而采用JungK、LEICA SM等重型切骨机行不脱钙切片，根据需要，可准确获得不同厚度的切片（5～10 μm），简捷、省时、准确。
2.1.7 染色
染色方法需根据测量目的而选择，如Toluidine blue（甲苯胺蓝），可清晰地显示矿化骨小梁、类骨质、成骨细胞、破骨细胞；Masson染色可清晰区分类骨质、矿化骨小梁，但不易区分细胞；H．E染色可区分细胞，但不如甲苯胺蓝清晰。其他〔4〕尚有Von Kossa氏法、Solochro me CyaninR、Goldnen’s Trichrome等，还有像改良的Giemsa、PAS、AB-PAS等。每一种染色方法，无论单一的还是复合的，都使各种组织成分有特定的着色，以便于镜下精确地辨认。
2．2 采图
现在一般都采用一套将显微摄像与机相连的特殊图像采集系统（如Nikon Spot图像采集系统）采图。采图需注意样本的代表性与可比性。应遵循等距随机抽样的原则；同一标本的照片或视场数的增加并不代表实际研究例数的增加；不同标本的采图部位应基本一致，如均在外骨痂或内骨痂，以使其具有可比性。采图的同时最好用标尺定好标。
2．3 测量
切片制成后就可以进行测量，目前较常用的测量方法有3种〔2〕，3种方法都是根据Delesse原理，即根据平面的测量推测或转换为三维的参数。第一种方法为目镜测量盘测量法，第二种方法为计算机图像测量法，第三种方法为半自动图像分析法。前两种方法均有各自的缺点，第三种方法具备了前两种方法的优点，且避免了二者的不足，故为最常用的方法。一个特制的数据计算盘和一个发光的游标（或画笔）与显微镜的光学系统联结，即可进行半自动图像分析。工作时数据盘与游标映入镜下，与切片的图像重叠，游标在数据上的移动犹如在切片的图像上移动。这样游标上的光点沿着欲测的组织结构移动便可以进行点计数、直线或曲线长度、周长及面积的测量。数据盘的边缘部分设有详细程序，根据需要可选择相应的程序进行测量，在与数据盘相接的微处理机上显示测量的数据。
2．4 骨组织形态计量学参数
上述测量仅测出了特征物的二维长度和面积（点计数除外），根据体视学原理，尚需转换为三维参数。这样，二维的长度与面积应理解为三维的面积与体积。现在有专门的骨科软件可供使用，若无，则需代入相应公式计算。骨组织形态计量学参数共60多个，具体可分为静态参数和动态参数，常用于研究骨折愈合的参数〔5~7〕有：
2.4.1 静态参数
①类骨质均宽（Osteoid width，O.Wi）：将类骨质测n次宽度后，取平均值。
公式：O.Wi=类骨质宽度之和/n （μm）
②类骨质表面（Osteoid surface，OS）：指类骨质表面长度占骨小梁表面长度的比例。
公式：OS=类骨质表面长度/骨小梁表面长度 （%）
③类骨质体积（Osteoid volume，OV）：类骨质面积占骨组织面积的比例。也叫类骨质体积密度、体积分数、面积分数。
公式：OV=类骨质面积/骨组织面积 （%）
④成骨细胞指数：指每1 mm骨小梁表面长度平均成骨细胞个数 （个/mm）。
⑤矿化骨痂均宽（Mineralization width，MLW）：将矿化骨痂测n次宽度后，取平均值 （μm）。
⑥矿化骨痂体积（Mineralization volume ，MLV）：为矿化骨痂面积占骨组织面积的比例。其含义及公式同类骨质体积 （%）。
⑦破骨细胞吸收表面（Osteoclastic resorption surfaces，ORS）： 指Houseship陷窝的表面长度与骨小梁表面长度的比值（%）。
⑧破骨细胞指数：指每1 mm骨小梁表面长度平均破骨细胞个数（个/mm）。
上述①②③④为骨的形成参数，⑤⑥为骨的结构参数，⑦⑧为骨的吸收参数。
2.4.2 动态参数
①矿化率（Mineralizition rate，MAR）：指每日在活性成骨表面新沉积的矿化骨厚度。
MAR=双标记带平均宽度/双标记间隔天数（μm/d）
②纠正矿化率（Adjusted Mineralization rate，jMAR）：
jMAR=MAR×双标长度/类骨质表面长度（μm/d）
③矿化延迟时间（Mineralization lagtime）：类骨质宽度除以纠正矿化率即为矿化延迟时间。
④骨形成率（Bone formation rate，BFR）：
BFR=矿化率×单标长度×（骨小梁表面长度/骨小梁面积）×100（μm2/μm・d）。
⑤骨吸收率（Bone erosion rate，BER）：
BER=吸收陷窝深度/吸收陷窝表面长度×（平均骨壁厚度/MAR）（μm2/μm・d）
平均骨壁厚度是粘和线到骨小梁表面的距离，甲苯胺蓝染色不易观察，需用特定的染色方法。
⑥其他尚有骨重建周期、双标记表面和单标记表面等参数。
3 结语
骨组织计量学与骨折愈合的研究，尽管费时、费力、所需设备昂贵，但它使得过去对骨折的“定性”或间接认识上升到“定量”或直接认识的新高度。在此过程中仍需强调的是，必须遵循随机抽样、采图并忠实记录等原则。分析参数时，应结合骨折愈合的不同时期，静、动态参数的对比分析，如类骨质并非在各时期都是越多越好，若在后期类骨质多，矿化率低，说明成骨细胞功能活跃，但骨折愈合的关键一环――矿化存在障碍。必要时还应结合其他生化指标、生物力学指标进行分析，方可得出可靠结论。
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〔1〕Wiliam AP. Bone and mineral research［M］. Amsterdan: Excepta Medica,1983.191-222.
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〔4〕席越，王戈平.骨组织病理解剖学技术［M］.北京:人民卫生出版社，1997.308-322.
〔5〕于顺禄，白仁骁.骨重建过程四环素活体标记骨组织形态计量学指标在骨质疏松中的应用［J］.体视学与图像分析，2003，8（2）：119-123.
〔6〕刘忠厚.骨质疏松学［M］.北京：出版社，1998.443-455.
〔7〕洪定钢，时光达．淫羊藿影响骨折愈合的骨组织学及骨组织形态计量学研究［J］．中医正骨，1999，11（2）：3-6.
