胆固醇结石患者胆汁凝血因子及纤维蛋白与结石形成关系的研究
作者：叶生爱，秦永林，韩天权，芦慧霞，王凤臣，高乃荣，嵇振岭，杨德同，张圣道，汤文浩
［摘要］目的: 通过研究胆囊胆固醇结石（简称胆石）患者胆石或胆囊胆汁中的纤维蛋白和凝血因子来阐明纤维蛋白在胆固醇结石形成中的作用。 方法: 收集胆石患者胆囊胆汁25份及非胆石患者胆囊胆汁15份，测定凝血酶原片段1+2（F1+2）、抗凝血酶Ⅲ抗原与活性、纤溶酶消化前后D.二聚体及总蛋白水平。取胆石15枚，制作成石蜡切片，分别行PAS染色、纤维蛋白和因子免疫组织化学染色。 结果: 胆石患者胆汁中F1+2、抗凝血酶Ⅲ抗原、抗凝血酶Ⅲ抗原含量与活性之比、D.二聚体、总蛋白和纤维蛋白含量均高于非胆石组（P<0.05或P<0.01）;抗凝血酶Ⅲ活性却低于非胆石组（P<0.05）;胆石组胆汁经纤溶酶消化后D.二聚体水平显著升高（P<0.01）。胆石中的蛋白提取物经纤溶酶消化后可检测到D.二聚体。胆石切片PAS染色、纤维蛋白和 因子免疫组织化学染色均呈现阳性网状结构分布。 结论: 胆石患者的胆汁处于“血栓前”状态，成石胆汁中有大量的交联纤维蛋白生成与累积;纤维蛋白与 因子参与了胆石网状结构的形成。 ［关键词］ 胆固醇结石;凝血因子;纤维蛋白
自1969年Okamoto首次从人胆囊胆汁中提纯出纤溶酶原激活物胆激酶后，1997年Scott.Coombes［1］ 又报道，在胆囊胆固醇结石（简称胆石）患者的胆囊胆汁中有组织型纤溶酶原激活物（t.PA）、尿激酶型纤溶酶原激活物（u.PA）、纤溶酶原激活物抑制剂1和2（PAI.1、PAI.2）存在，其中t.PA、u.PA与非胆石组相比无明显差异，而PAI.1、PAI.2却明显高于正常胆汁。本实验组在先前的研究中通过对胆汁中抗凝血酶Ⅲ、纤溶酶活性、α 2 .抗纤溶酶活性、PAI.1和D.二聚体等指标的研究发现，胆石患者胆囊胆汁处于一种“高凝”和相对低纤溶状态［2］ ，随后又发现在成石胆汁中含有大量的组织因子（TF）和低水平的组织因子途径抑制物（TFPI）［3］ 。组织因子是凝血过程的重要启动因子，“高凝”状态可导致纤维蛋白的产生，而胆汁中高水平的PAI.1、PAI.2将会影响到交联纤维蛋白的清除。前人的实验提示在成石胆汁中可能有大量的交联纤维蛋白产生和累积。本实验旨在进一步对胆汁和胆石中的凝血因子与纤维蛋白进行研究，阐明纤维蛋白在胆石形成中的作用。
1 对象与方法
1.1 研究对象及标本制作
胆石患者25例:男性8例，年龄30～70岁，中位年龄50岁;女性17例，年龄35～66岁，中位年龄56岁。非胆石患者15例，为同期住院的上腹部手术患者:男性9例，年龄37～69岁，中位年龄58岁;女性6例，年龄40～68岁，中位年龄50.5岁;均经B超确诊无胆囊结石与胆管结石。病例的选择均符合以下条件:体重<150%标准体重，无高血压、高血脂或糖尿病，肝肾功能正常，无出血或血栓性疾病，术前血小板计数、PT和APTT正常，近1个月未急性发作，未服用非甾体类抗炎药、胆汁酸制剂或钙拮抗剂等，口服胆囊造影显影，女性患者近期未服用避孕药且未妊娠。两组患者开腹后立即用细针穿刺胆囊，尽可能吸尽全部胆汁。抽出的胆汁立即分成5或6份，蓄于Eppendoff管中，-70℃冻存备用。收集胆石15人份，蒸馏水冲净结石表面的胆汁与碎屑，用无菌刀片将结石剖成两半，真空冻干保存至恒重，一半用于制作切片，一半用于蛋白提取。胆石患者的胆石均为傅培彬8类分类法中的第1、2和3类。
1.2 检测指标与方法
（1）将胆汁在37℃迅速解冻后，4℃10000×g离心10min，取上清测凝血酶原片段1+2（prothrombin fragment1+2，F1+2）、抗凝血酶Ⅲ抗原及活性、D.二聚体水平;取10μl胆汁，采用考马斯亮蓝法测定总蛋白量［4］ ;另取100μl胆汁用纤溶酶稀释液稀释至190μl，加0.1g・L -1 的纤溶酶10μl，37℃孵育2h后加入抑肽酶至终浓度300MIU・L -1 ，4℃10000×g离心10min，取上清测D.二聚体水平。（2）取一半胆石标本，在液氮中碾碎，称取100mg胆石，经反复提取除净胆固醇后其残渣用N 2 吹干，加稀释液100μl，再加0.5g・L -1的纤溶酶10μl，37℃孵育24h后加入抑肽酶至终浓度 为300MIU・L -1 ，4℃10000×g离心10min，取上清测D.二聚体水平。（3）胆石的组织化学研究:取另一半胆石标本AMeX法［5］ 固定后，采用石蜡切片火棉胶增强技术［6］ ，在蜡块削出完整平面时，用2%火棉胶于蜡块表面迅速涂胶，并用冷风快速吹干后切片，每个标本均切4μm厚的连续切片4张。常规烤片后将切片置于无水乙醇乙醚（1∶1）液中浸泡，直至火棉胶脱净，再用1mol・L -1 盐酸浸泡切片，继用氯仿溶去胆红素。经上述处理后切片分别行高碘酸Schiff's（periodic acid Schiff's，PAS）染色、纤维蛋白单克隆抗体和 因子多克隆抗体SABC染色以及5mol・L -1 尿素37℃孵育30min后纤维蛋白单克隆抗体SABC染色。（4）D.二聚体和F1+2抗原采用酶联免疫吸附法测定，抗凝血酶Ⅲ抗原用免疫浊度法测定，抗凝血酶Ⅲ活性用发色底物法测定（为避免胆汁本身颜色干扰，本实验设立自身对照）。抗凝血酶Ⅲ抗原与活性试剂盒、D.二聚体试剂盒购自上海太阳公司，F1+2试剂盒、纤溶酶、抑肽酶、纤维蛋白单克隆抗体和因子多克隆抗体均购自美国ADI公司，SABC免疫组织化学试剂盒购自武汉博士德公司。
1.3 统计学处理
结果以ˉx±s表示，统计数据用SAS统计软件检验分析，P<0.05为有统计学意义。
2 结果
检测结果见表1、2。从表1可知，胆石组胆汁F1+2水平明显高于非胆石组（P<0.05）;胆石组总蛋白水平和D.二聚体水平也显著高于非胆石组（P<0.01）;纤溶酶消化前后胆石组胆汁D.二聚体含量差值明显高于非胆石组（P<0.01）。胆石组胆汁中抗凝血酶Ⅲ抗原、抗凝血酶Ⅲ抗原与活性之比均高于非胆石组（分别为P<0.01和P<0.05），而抗凝血酶Ⅲ活性却低于非胆石组（P<0.05，见表2）。胆石的组织化学研究结果见图1、2、3和4:胆石切片PAS染色、纤维蛋白和因子免疫组织化学染色均有阳性的网状结构分布，3种染色的网状结构分布基本一致;另一组切片经5mol・L -1 的尿素37℃孵育30min后再行纤维蛋白免疫组织化学染色，其纤维网孔的大小、框架结构的直径并无明显改变。3类胆石经纤溶酶消化后均可检测到D.二聚体分别为（1.062±0.210）×10 -5 、（1.332±0.219）×10 -5 及（1.541±0.236）×10 -5 mg・（100mg） -1 ，3组之间差异无显著性。
表1 胆汁中各种指标与纤维蛋白的含量（略）
Tab1 Levels of D.dimer，F1+2，total proteins and fibrin in the bile of two group patients
注:A表示消化后与消化前D.二聚体含量差值
表2 胆汁中抗凝血酶Ⅲ抗原含量与活性的比较（略）
Tab2 Levels of antigen and activity of antithrombinⅢin the bile of two group patients
图1 胆固醇结石切片PAS染色，其网状结构呈阳性 ×200（略）
Fig1 Positive network of the gallstone section after PAS staining ×200
图2 胆固醇结石切片纤维蛋白单体2（Fn2）免疫组织化学SABC染色，其网状结构呈阳性，形态分布与PAS基本一致 ×200（略）
Fig2 Positive network in the gallstone section by immuno-histochemical staining of Fn2，showing almost the same network distribution as the PAS staining ×200
图3 胆固醇结石切片 因子免疫组织化学SABC染色，网状结构也呈阳性，其形态分布与PAS、Fn2基本一致 ×200（略）
Fig3 Positive network in the gallstone section by immunohistochemical SABC staining of factor ，showing almost the same network distribution as the PAS，Fn2staining ×200
图4 胆固醇结石切片经5mol・L -1 尿素孵育30min后Fn2SABC染色，其网状结构仍呈阳性，网状结构孔径无明显改变 ×200（略）
Fig4 Positive network immunohistochemical SABC staining of Fn2in the gallstone section after incubation with5mol・L -1 urea for30min ×200
3 讨论
3.1 成石胆汁呈血栓前状态
凝血酶原激活是凝血过程中的关键步骤之一。当活化Ⅹ因子（FⅩa）作用于凝血酶原，精氨酸273.苏氨酸274间的肽腱断裂，氨基端释放出F1+2，生成前凝血酶2，随后在FⅩa的作用下继续酶解生成凝血酶。
F1+2是机体发生凝血反应的早期产物，其水平升高灵敏地反映了凝血功能增强，凝血酶生成增多。它既是因子Ⅹa的直接分子标志又是凝血酶形成的间接分子标志，且半衰期较长（90min），检测时受体外因素的影响较小，在反映凝血激活方面优于纤维蛋白肽A、抗凝血酶Ⅲ、蛋白C和蛋白S的测定［7］ 。若联合检测凝血酶.抗凝血酶Ⅲ复合物（TAT）和D.二聚体，对诊断深静脉血栓等则有更高的特异性和敏感性。TAT升高而F1+2正常，提示机体处于一种轻度的凝血状态;TAT和F1+2都升高，则提示凝血酶大量产生，凝血功能增强，机体呈现血栓前高凝状态;如在TAT和F1+2升高的同时伴有D.二聚体升高，说明在凝血激活的同时继发纤溶系统激活;若测得D.二聚体水平升高而TAT和F1+2正常，则提示有陈旧性血栓或病情无大的变化［8］ 。目前F1+2、TAT和D.二聚体三者联合测定已广泛应用于血栓性疾病的诊断、病情演变及预后的评估。
本实验结果显示:胆石组患者胆囊胆汁中F1+2含量高于非胆石组，两组差异显著（P<0.05）;而胆石组抗凝血酶Ⅲ的活性降低，抗凝血酶Ⅲ抗原增高，表明胆石患者胆汁中TAT增高。F1+2与TAT增高提示胆石患者胆囊胆汁凝血功能增强，凝血酶大量产生，呈一种血栓前状态，与本实验组先前报道的结果［2，3］ 吻合，在高凝和低抗凝状态下，凝血酶原被大量激活。胆石组胆汁D.二聚体的含量也明显高于非胆石组（P<0.01），提示同时伴有继发纤溶系统的激活。以上3种指标的联合测定表明，成石胆汁呈现一种“高凝”状态和继发性纤溶亢进状态共存的局面。
3.2 成石胆汁中有大量的交联纤维蛋白产生与累积
交联纤维蛋白分子质量较大，易与其他蛋白发生交联聚合，不易直接提取与检测。D.二聚体是交联纤维蛋白降解产生的一种特异性产物，其水平升高除表明有交联纤维蛋白生成与降解外，同时还表明体内凝血酶生成增多和继发性纤溶亢进，其水平能反映交联纤维蛋白的浓度［9］ ，故本实验通过检测胆汁中D.二聚体的水平来观测胆汁中交联纤维蛋白的含量。表1结果显示，胆石组胆汁D.二聚体水平明显高于非胆石组，差异具有显著性（P<0.01），提示成石胆汁在高凝状态下，凝血酶生成增多，交联纤维蛋白大量产生，同时继发纤溶活性亢进，交联纤维蛋白大量降解。随后，作者应用纤溶酶对两组胆汁进行消化，结果发现，胆石组胆汁消化前后D.二聚体含量差值与非胆石组相比显著升高（P<0.01），约为非胆石组胆汁的40.24倍，强烈提示在胆石患者胆囊胆汁中有大量的交联纤维蛋白累积，这与秦永林等［2］ 报道的结果吻合。另外，胆石组胆汁中总蛋白含量比非胆石组高约6.88倍，而交联纤维蛋白的含量（纤溶酶消化前后D.二聚体含量差值）约为非胆石组胆汁的40.24倍，增加的倍数明显比总蛋白增加的倍数高，提示在各类参与结石形成的糖蛋白当中纤维蛋白可能起了较重要的作用。
3.3 胆石组织化学研究
3.3.1 胆石网状结构由PAS阳性的糖蛋白构成 本实验采用火棉胶增强技术把胆石制作成石蜡薄切片，经脱胆红素等处理后有PAS阳性的网状结构分布（见图1），提示胆石网状结构由大量的糖蛋白构成。这种网状结构在胆石中广泛存在，这已被许多学者所证实。糖蛋白作为胆石的两大组分之一，其成石机制仍未彻底解决。目前认为糖蛋白的凝聚及络合作用系胆石形成的主要因素，而糖蛋白与胆红素颗粒之间可能也存在某种化学结合。因此，胆固醇和胆色素颗粒并不只是简单的镶嵌在糖蛋白纤维状网孔当中，在糖蛋白之间、糖蛋白与胆色素之间都可能发生了复杂的共价络合作用，从而形成难溶的高分子聚合物。
3.3.2 纤维蛋白参与胆石网状骨架的形成 纤维蛋白是一种碱性糖蛋白，在止血、炎症局限和组织修复等方面都发挥了重要的作用。纤维蛋白原在凝血酶作用下，先很快释放出纤维蛋白肽A（FPA）变成纤维蛋白单体1（Fn1），然后缓慢释放出纤维蛋白肽B（FPB）变成纤维蛋白单体2（Fn2），同时在a因子和Ca 2+ 作用下形成交联纤维蛋白。纤维蛋白原与Fn2比较，Fn2的α链和β链氨基末端与纤维蛋白原不同，抗Fn2单克隆抗体只与释放出FPB后的Fn2的β链氨基末端发生特异性反应，而不与纤维蛋白原发生反应。本实验采用特异性的抗Fn2单克隆抗体行胆石切片免疫组织化学染色，结果发现在胆石中也有阳性的网状结构分布，与PAS染色相似（见图2），提示丝网状的纤维蛋白与其他糖蛋白一起参与了胆石网状骨架的形成。随后，本实验应用纤溶酶对提取胆固醇后的胆石残渣进行消化，孵育24h后3类胆石均可检测到D.二聚体，进一步提示交联纤维蛋白参与了胆石的形成。
纤溶系统广泛存在于人体的各种管道当中，在血液系统与泌尿系统，纤溶系统通过对交联纤维蛋白的降解以防止凝血块和尿路结石的形成来维持管道的通畅［10］ 。本实验发现，纤溶系统同样存在于人体的胆囊当中，在非成石胆汁中有少量的D.二聚体存在，说明在非成石胆汁中曾有交联纤维蛋白产生，但通过正常生理纤溶系统的调节，并无交联纤维蛋白的大量累积和结石形成。而成石胆汁处于一种高凝的“血栓前状态”，有大量的交联纤维蛋白产生与累积。成石胆汁中高水平的D.二聚体正是机体的一种自我调节代偿性纤溶亢进的结果，但是纤溶系统最终无法完全降解成石胆汁和胆石中的交联纤维蛋白，从而导致胆石的形成和生长。
3.3.3 因子被激活并参与胆石网状结构的形成 因子是存在于血液、血小板和单核细胞中的一种糖蛋白，也称纤维蛋白稳定因子，是机体正常止血机制所必需的一种凝血因子。活化的 因子（a）通过催化相邻纤维蛋白单体γ链及α链上的赖氨酸和谷氨酸 残基形成ε（γ谷氨酰）赖氨酸键，使纤维蛋白单体共价交联，形成抗纤溶的纤维蛋白多聚体。在纤维蛋白单体聚合过程中如没有a作用，单体之间以非共价键形式互相连接，这种纤维蛋白很不稳定，可被5mol・L -1 的尿素溶解。本实验采用抗因子多克隆抗体（与因子a及b亚单位都可反应）行胆石切片SABC染色，发现也有阳性的网状结构分布（见图3），提示ХШ因子参与了胆石网状结构的形成。而另一组切片经尿素处理后再行Fn2SABC染色，其网状结构孔径的大小并未发生明显的改变（见图4），提示 因子在成石胆汁中被激活，从而促进交联纤维蛋白的生成，与纤维蛋白一起参与胆石网状结构的形成。另外，a还能使α 2 .纤溶酶抑制物、纤维连接蛋白与纤维蛋白发生交联，而成石胆汁中恰恰含有大量的α 2 .纤溶酶抑制物［2］ 与纤维连接蛋白。因此，在a作用下α 2 .纤溶酶抑制物、纤连蛋白与纤维蛋白可能也发生了交联，大大增强胆石的抗纤溶能力与稳固性，但这需进一步证实。
综上所述，作者认为，成石胆汁中大量的组织因子等凝血激活因素启动了外源性凝血激活途径，凝血酶原被激活，纤维蛋白大量产生。而成石胆汁中高水平的PAI.1、PAI.2、α 2 .纤溶酶抑制物和低水平的t.PA、u.PA抑制了纤溶活性，使纤溶活性并未相应增强，最终导致交联纤维蛋白的大量累积并参与胆石的形成与生长。但成石胆汁和胆石中的蛋白种类繁多，作用各一，纤维蛋白在胆石的形成中是否处于重要地位还有待进一步研究。
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