寿胎丸对SD孕鼠生殖功能及其胚胎发育的毒性研究

                 作者：刘丹卓，尤昭玲，赵新广 

【摘要】  目的 观察寿胎丸对SD孕鼠生殖功能及胚胎发育的毒性。 方法将孕鼠随机分成5组，即溶剂对照组、寿胎丸高剂量组（简称高剂量组）、寿胎丸中剂量组（简称中剂量组）、寿胎丸低剂量组（简称低剂量组）、阳性对照组。寿胎丸高、中、低剂量组采用灌胃给药。观察孕鼠增重、摄食量、交配率、受孕率等，并观察吸收胎、畸胎等异常状况。结果 寿胎丸不同剂量对孕鼠生殖功能状态、胎仔活胎率、吸收胎率和畸胎率的影响，与溶剂对照组比较差异均无统计意义。结论 寿胎丸药液在本研究所确定的 50 g/kg质量浓度以下，初步认为对健康育龄SD孕鼠生殖功能及其胚胎发育最大无损害效应水平为 50 g/kg。

【关键词】  寿胎丸；生殖毒性；安全性

    寿胎丸乃清代盐山名医张锡纯所创，出自《医学衷中参西录》，原为护胎而设，后经多年来临床医家们反复实践与锤炼，已成为胎漏、胎动不安、自发流产、滑胎的首选方。寿胎丸广泛用于妊娠期,其药效已得到了充分肯定,但临床运用安全性研究至今未见详细报道。有效评价药物对女性生殖功能的影响有着深远的意义，女性生殖系统是药物作用的一个特有的靶器官，女性生殖系统复杂且所有配子在出生前就已形成,所以其损害可能是多靶点及永久性的,并可导致完全绝育[1]。有鉴于此，本实验通过其不同剂量寿胎丸对SD孕鼠体内染毒，进行生殖毒性测定,以期获得其继药效学之后的临床前毒效学资料，为其孕期合理和安全应用提供实验依据。

    1材料与方法

    1.1  材料

    1.1.1药液制备

    对所需中药药材的来源及品种进行鉴定，筛选优质正品，原料经品种鉴定无误后，再进行挑选和洗净，然后炮制、切片、烘干、粉碎。严格按照经典处方比例用量配备，制取工艺如下：①取经加工炮制的标准中药饮片（菟丝子、续断、桑寄生）加蒸馏水6～8倍量，煎煮2次，每次1.5 h，合并滤液，浓缩至相对密度为1.1～1.2（50 ℃～60 ℃）；②加入乙醇使醇含量达65 %，冷藏24 h，醇液滤过，滤液回收乙醇，至无醇味；③阿胶烊化；④以上两液合并，滤过；⑤滤液冷藏放置，视无沉淀析出；⑥添加蒸馏水，调pH值至6.5～7.0,并调整至相当于含生药2 g/mL；⑦精滤、灌封、灭菌。

    1.1.2主要试剂与仪器

    40 %甲醛，北京化学试剂公司生产；冰乙酸，北京化学试剂公司生产；95 %乙醇，北京化学试剂公司生产；丙三醇，北京化学试剂公司生产。光学显微镜：日本OLYMMPUS SZ-ST型。分析天平：美国AG-104，感量值0.01 g。游标卡尺：天津仪器厂生产。

    1.1.3实验动物

    取经检疫1周的健康性成熟未经交配生育的Sprague|Dawley SPF/VAF级大鼠，雌雄各150只。年龄约 80～90 d，体质量约200～220 g(♀)，350～380 g(♂)。以上动物由北京维通利华实验动物技术有限公司提供，动物合格证号：SCXK(京)2007-0001。使用北京科澳协力饲料有限公司生产的标准膨化饲料在标准饲养盒内喂养，饲料合格证号：SCXK(京)2005-0007。每盒5只,盒内保持清洁干燥，定时定量向饲料盒添加足量饲料，由动物自由摄食。饮水采用经DWT型二氧化氯消毒机处理后聚乙烯塑料瓶装消毒饮用水，由动物自由饮用。每日清洗饮水瓶，并更换饮用水1次。SPF级动物房日光灯明暗交替12 h，室温22 ℃～25 ℃,湿度30 %～70 %。

    1.2方法

    1.2.1实验分组

    采用交配后动物分组法：将当日已交配受精鼠称重,按体质量排序，以每组5只（1盒）将受精鼠按体质量依溶剂对照组、寿胎丸低剂量组（简称低剂量组）、寿胎丸中剂量组（简称中剂量组）、寿胎丸高剂量组（简称高剂量组）、阳性对照组（环磷酰胺组，代号CP）顺序随机分配，并尽量使各组受精鼠数相近。次日交配受精雌鼠再按体质量编号依次随机分配到前一日未分配组别或下一轮次组别中。交配结束前少量受精鼠再按体质量编号依次补充至受精雌鼠数较少的组别中，使各组受精鼠总数相近。最终各实验组分组只数见表1。

    1.2.2给药方法

    各剂量组大鼠分上下午2次固定时间灌胃给药，与人临床拟用途径相同，给药剂量见各表,高剂量相当于人临床用量的200倍。于妊娠期第6 d开始给药，连续给药10 d。给药期间依体质量变化随时调整给药体积。溶剂对照组：同期灌胃蒸馏水，给药体积设计与各剂量组给药体积相当，并依体质量变化随时调整给药体积。阳性对照组：采用腹腔注射给药，给药期限从妊娠第11 d至妊娠第13 d，给药剂量7 mg/（kg·d）。

    1.2.3动物体征观察及体质量、摄食量测定

    给药期间每3天称1次体质量，并计数。给药日起至处死日每日上下午观察大鼠各1次，记录动物外观、行为或异常体征。给药日起至处死日每3天测定1次每盒大鼠摄食量。

    1.2.4动物同笼交配、受精检查

    雌雄鼠每日16：00以1∶1的比例放交配笼同笼交配，于次日8：00检查阴栓。发现阴栓记为交配受精，将已交配雌鼠称重。发现阴栓之日定为妊娠第0 d，第2 d为妊娠第1 d，以此类推。交配期2周，记录每组受精鼠总数。

    1.2.5实验步骤及观测指标

    妊娠第20 d颈椎脱臼处死孕鼠,处死后即称重,孕鼠体质量及增重，并计算摄食量。切开腹部暴露两侧子宫及内脏器官,并计数总着床数、黄体数。发现内脏异常做记录,并做组织病检查。纵向切开子宫,分离胎仔,记录死胎、活胎和早晚吸收胎,计算孕鼠交配率、受孕率和死亡率。最后子宫做病理学检查。

    1.3统计学分析

    全部数据统计分析均采用SAS 9.13版软件，由机完成。各组孕鼠平均体质量、摄食量等计量资料以均数±标准差（±s）表示，数据采用t检验进行显著性分析。活胎、死胎、畸胎、早晚吸收胎等计数资料以百分率（%）表示，数据采用χ2检验进行显著性分析。

    2结果

    2.1  寿胎丸对妊娠期雌鼠摄食量影响

    采用高中低不同剂量染毒，各剂量组雌鼠在整个妊娠期过程中的摄食量均与溶剂对照组相近，差异无统计意义（P＞0.05）。阳性对照组妊娠期雌鼠摄食量也与溶剂对照组相近，差异无统计意义（P＞0.05）。见表1。表1寿胎丸不同剂量对妊娠期雌鼠摄食量影响注： GD2-GD5即妊娠期第2至第5 d,其余类推。

    2.2  寿胎丸对孕鼠体质量及妊娠期增重影响

    设高、中、低寿胎丸不同剂量分别对SD孕鼠染毒，结果高、中、低不同剂量组孕鼠妊娠期体质量变化均与溶剂对照组孕鼠基本相当,差异无统计意义（P ＞0.05）。高剂量染毒组孕鼠妊娠期增重略低于溶剂对照组，但经统计学处理，差异无统计意义（P ＞0.05）。而阳性对照组孕鼠GD20体质量变化及妊娠期增重明显低于溶剂对照组，差异有高度统计意义（P＜0.01）。分析原因可能与该药本身造成的母体毒性导致胎仔体质量较低有关。见表2。表2寿胎丸不同剂量对孕鼠体质量及妊娠期增重影响 注：与溶剂对照组比较*P<0.01。妊娠期增重=GD20体重-GD6体重-子宫连胎重。

    2.3  寿胎丸对妊娠期雌鼠生殖状态影响1

    各实验组孕鼠受孕率为80.77 %～87.50 %，寿胎丸高、中、低剂量组及阳性对照组均与溶剂对照组比较，差异无统计意义（P＞0.05）。实验期内各组均未发现动物死亡。各实验组孕鼠的黄体数与总着床数相近，仅有少量着床前胚胎丢失，各剂量组及阳性对照组均与溶剂对照组比较，着床前胚胎丢失率差异无统计意义（P＞0.05）。各实验组孕鼠平均着床数为11.76～13.25，各剂量组及阳性对照组均与溶剂对照组相比，差异也无统计意义（P＞0.05）。见表3。表3寿胎丸不同剂量对妊娠期雌鼠生殖状态影响1

    2.4  寿胎丸对妊娠期雌鼠生殖状态影响2

    寿胎丸各剂量组活胎率为97.74 ％～98.51 ％，溶剂对照组活胎率为97.57 ％，各剂量组与溶剂对照组比较，其活胎率差异无统计意义（P＞0.05）。各剂量组孕鼠的死胎率与溶剂对照组相当，在0.0 ％～0.4 ％之间，仅偶见死胎。寿胎丸不同剂量组的吸收胎率，均与溶剂对照组相当，差异无统计意义。在胎鼠畸形方面，其高、中、低不同剂量组胎鼠的畸胎率（0.75 %～ 1.54 %）与溶剂对照组（1.24 %）相比，差异无统计意义（P＞0.05）。阳性对照组活胎率（87.94 %）和死胎率（0.39 %）均与溶剂对照组相近，但畸胎率（37.61 %）和吸收胎率（11.67 %）明显高于溶剂对照组，差异有高度统计意义(P<0.01)。见表4。表4寿胎丸不同剂量对妊娠期孕鼠生殖状态影响2注：与溶剂对照组比较*P<0.01

    3讨论

    合理使用药物，特别是减少药物毒性对妊娠妇女机体的损害，一直是临床用药的宗旨。但是，许多临床中应用于妊娠期、围生期等中药或复方，由于其疗效肯定，而其潜在生殖或遗传毒性并没有引起人们足够重视，也正是由于这种忽视，方药的潜在毒性可能直接或间接地作用于DNA分子，使DNA的复制或修复过程受阻，从而引起疾病发生，甚至遗传给下一代。目前国内外所涉及的药物生殖毒性研究方法数以百计，常用的也有十余种[2]。如致畸敏感期毒性试验、胚胎毒性试验、一般生殖毒性试验、围产期生殖毒性试验、行为畸胎学试验等。研究方法虽多，但基本上没有依据中医药自身特点所建立的生殖安全性研究体系。基于中医的辨证论治，方药的遣方配伍原则，寿胎丸广泛用于妊娠期，而胚胎器官形成期对药物作用最为敏感，为此，本研究采用动物胚胎致畸敏感期作为药物作用的时间靶点进行生殖毒性试验。

    本研究采用寿胎丸3个不同剂量对妊娠期雌鼠染毒，各剂量组雌鼠在妊娠期摄食量、体质量及增重均与溶剂对照组相近，说明药物本身没有造成明显的母体毒性而导致胚胎发育体质量偏低。剖宫检查时，未发现内脏异常，进一步说明药物对母体未见明显毒性。各实验组孕鼠受孕率、黄体数与总着床数相近，仅有少量着床前胚胎丢失，与溶剂对照组比较，均未见明显差异。各实验组孕鼠平均着床数、活胎率，均与溶剂对照组相当，未见有明显差异。不同剂量组胎鼠吸收胎率、畸胎率与溶剂对照组相比，差异无统计意义。这提示寿胎丸对妊娠期孕鼠生殖功能状态未见明显影响，且无明显致胎仔畸形作用。综合以上实验结果，在本研究所确定的条件下，寿胎丸药液对健康育龄SD孕鼠生殖状态、胚胎发育最大无损害效应水平应为50 g/kg。

【】
  [1]刘育谷.卫生毒[M].北京：人民卫生出版社，2003：103.

[2]付立杰．毒理学在化建设中面临的机遇和挑战[J].中国药理学和毒理学杂志，2000，14(5)：326.