不同产地金银花中绿原酸和木犀草苷含量的HPLC法测定

               作者：宋平顺，卫玉玲，陶耀武，丁永辉

【摘要】  目的 通过HPLC法测定不同地区人工栽培金银花中绿原酸和木犀草苷的含量，考察甘肃金银花质量状况。方法 绿原酸色谱柱：C18色谱柱（4.6 mm×250 mm，5 μm），流动相为乙腈-0.4 %磷酸（13∶87），流速为1.0 mL/min，检测波长为327 nm。木犀草苷色谱柱：苯基色谱柱（4.6 mm×250 mm，5 μm），流动相为乙腈-0.5 %冰醋酸（二元梯度洗脱），流速为1.0 mL/min，检测波长为350 nm。结果 甘肃不同地方栽培的金银花中，绿原酸、木犀草苷含量分别占2.16 ％～3.63 %、0.0532 %～0.1407 %，均符合药典以及补充检验方法的规定。结论 甘肃栽培品金银花的质量与山东、河南道地产区相当。

【关键词】  金银花；绿原酸；木犀草苷；HPLC

    金银花为常用中药材，具有清热解毒、凉散风寒的功效，《中国药典》收载为忍冬科植物忍冬Lonicera  japonica Thunb的干燥花蕾或带初开的花[1]。金银花具有广泛的生态适应性，全国除西藏、青海、新疆、宁夏、内蒙古和海南以外，其他省（市、区）均有分布，野生资源比较丰富[2]。我国人工栽培金银花已有270多年的，近年来种植迅猛，山东、河南、湖南、河北、山西、甘肃、四川、贵州、新疆等地都有栽培，以山东、河南为主产区，习惯认为山东产量大，而河南品质佳[2]。金银花除在药品、保健、轻等领域广泛应用外，同时也是一种生态环保型的林木，根系发达，具有蓄水保土和防风固沙的作用，茎叶还可以做牛羊饲料，还是美化环境的花卉，人工栽培金银花其社会经济效益十分显著。

    甘肃野生金银花分布于天水、陇南地区，仅有资源而无商品，2001年以来，金昌、白银、兰州和陇南等地人工栽培成功，其中金昌、陇南已经建立商品基地。目前，国内关于金银花的质量主要以绿原酸、异绿原酸、咖啡酸和挥发油等指标成分进行评价[3-5]，甘肃人工栽培的金银花质量评价未见报道，本文采用HPLC法测定甘肃栽培金银花中绿原酸和木犀草苷含量，并与国内其他产区比较，为今后甘肃发展人工资源和选择GAP适宜的基地提供依据。

    1仪器、试药与样品

    1.1仪器

    美国Waters515型泵、Waters717自动进样器、Waters2487型紫外检测器、超声波清洗器KQ2500（昆山市超声仪器有限公司）。

    1.2试药

    绿原酸（110753-200413）、木犀草苷（11720-200603），供含量测定，由中国药品生物制品检定所提供；乙腈为色谱纯，水为娃哈哈纯净水，其余试剂为分析纯。

    1.3样品

    金银花样品分别购于金昌（金川宁远堡镇）、白银（靖远）、兰州（皋兰、兰州市城关区）和陇南（徽县）等地；山东、河南、四川为市售商品。以上均经作者严格鉴定。

    2方法与结果

    2.1  绿原酸含量测定[1]

    2.1.1色谱条件

    大连伊利特C18色谱柱（4.6 mm×250 mm,5 μm）；流动相为乙腈-0.4 %磷酸（13∶87）；流速1.0 mL/min；检测波长327 nm；柱温为室温。理论塔板数按绿原酸应不低于1000。

    2.1.2  对照品溶液的制备

    精密称取绿原酸对照品10.2 mg，置50 mL棕色量瓶中，用50 %甲醇稀释制成每毫升含45 μg的溶液。

    2.1.3  供试品溶液的制备

    取样品（过3号筛）0.5 g，精密称定，置50 mL容量瓶中，加50 %甲醇50 mL，称定重量，超声处理（功率250 W，频率33 kHz）30 min，放冷，再称定重量，用50 %甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，精密取续滤液5 mL，置25 mL棕色量瓶中，加50 %甲醇定容至刻度即得。

    按以上色谱条件得到对照品、金银花色谱图。见图1、图2。

    图1对照品HPLC图

    图2样品HPLC图

    2.1.4  样品的测定

    14批金银花样品按“供试品溶液制备”方法制备样品，精密吸取对照品溶液、供试品溶液各10 μL，注入液相色谱仪，以干燥品计算含量，结果见表1。

    2.2  木犀草苷含量测定及补充检验方法[1]

    2.2.1色谱条件

    苯基色谱柱（4.6 mm×250 mm,5 μm）；流动相为乙腈-0.5 %冰醋酸，二元梯度洗脱，0～15 min，乙腈10 ％～20 %，15～30 min，乙腈20 %，30～40 min，乙腈20 ％～30 %；流速1.0 mL/min；检测波长350 nm；柱温为室温。理论塔板数按木犀草苷计算应不低于20000。

    2.2.2  对照品溶液的制备

    精密称取在五氧化二磷干燥器中减压干燥12 h的木犀草苷对照品9.40 mg，置50 mL量瓶中，用70 %乙醇定容即得对照品储备溶液。

    2.2.3  供试品溶液的制备

    取样品（过3号筛）2 g，精密称定，置50 mL容量瓶中，精密加70 %乙醇50 mL，称定重量，超声处理（功率250 W，频率33 kHz）60 min，放冷，再称定重量，用70 %乙醇补足减失的重量，摇匀，滤过，精密取续滤液10 mL，回收溶剂，残渣用70 %乙醇溶解，转移至5 mL容量瓶，并定容即得。

    按以上色谱条件得到对照品、金银花色谱图。见图3、图4。

    图3对照品HPLC图

    图4样品HPLC图

    2.2.4线性关系考察

    分别精密称取2 mL木犀草苷对照品储备溶液，置于10 mL量瓶中，加70 %乙醇稀释定容至刻度，摇匀。分别取5，10，15，20，25，30和40 μL注入液相色谱仪，记录峰面积，以进样量（X）为横坐标，以峰面积（Y）为纵坐标，绘制标准曲线，线性方程为：

    X=0.003 Y+1.5570，ｒ=0.9999。结果表明，在0.188～1.504 μg范围内线性关系良好。

    2.2.5精密度试验

    对同一批金银花样品（徽县）按“供试品溶液制备”方法制备，精密吸取1 μL，注入液相色谱仪，测定峰面积，重复进样5次，出峰面积RSD为1.58 %。

    2.2.6稳定性试验

    对同一批金银花样品（徽县）按“供试品溶液制备”方法制备，分别于配后0，2，4，6，8 h，精密吸取10 μL，注入液相色谱仪，测定峰面积，RSD为2.43 %。结果表明，木犀草苷在8 h内基本稳定。

    2.2.7重现性试验

    对同一批金银花样品（徽县）按“供试品溶液制备”方法，取5份制备，精密吸取10 μL，注入液相色谱仪，测定木犀草苷的含量为0.0532 %，RSD为1.58 %。

    2.2.8回收率试验

    取6份已知含量的同批样品1.0 g（产徽县，木犀草苷含量为0.0532 %），精密称量，分别加入对照品储备溶液3 mL，按供试品溶液的制备方法制备，进行测定，计算平均回收率为98.56 %，RSD为2.68 %。

    2.2.9  样品的测定

    14批金银花样品按“供试品溶液制备”方法制备样品，精密吸取对照品溶液、供试品溶液各10 μL，注入液相色谱仪，以干燥品计算含量，结果见表1。表114批金银花样品含量测定

  3  讨论

    甘肃省6个不同地方栽培的金银花中，绿原酸、木犀草苷分别在2.16 ％～3.63 %、0.0523 %～0.1407 %，其含量均达到《药典》及补充检验方法的限度规定（绿原酸不得低于1.5 %、木犀草苷不得低于0.050 %），与山东、河南主产区相当或略高。药材性状方面，金昌、徽县呈黄白色，而靖远呈黄绿色，皋兰呈浅绿色，这与产地采用的干燥方法（阴干、晒干或烘干等）不同有关。

    金银花作为观赏植物在甘肃省内广为家种，作为药用资源是近几年从山东等地引种，虽然引种地区的地理环境差异较大，但由于金银花的生态适应性强，均取得了成功。金昌、靖远、皋兰种植于盐碱地，靖远、皋兰属于黄河流域，而徽县种植于山区，以上产区均符合金银花“以豫西山地、沂蒙山区及黄河故道区为重点建设金银花生产基地”的适宜区分析[6]。初步认为以上地区是金银花适宜种植地区，值得进一步加强种植技术研究，提高品质。甘肃其他地方仍可试验引种。

    金银花原植物的种内变异很大，报道10种变异类型。在植物形态、绿原酸以及产量等方面有较明显的差异[3]。目前我国栽培的金银花品系较多，优良品种少，不少地方栽培面积较为分散；生产技术与加工不规范，故在引种时应考虑优良品种。同时，应进一步培育适合甘肃地方的不同用途的金银花品种。

    金银花的品质受多种因素的影响，包括生长环境、栽培技术、采收季节、加工方法以及储存等，如生于阳坡金银花中的绿原酸高于阴坡；花朵不同发育阶段所含绿原酸不同，呈动态变化；储存的时间延长，绿原酸含量下降[3-4]；不同的加工方式对金银花的外观、气味等质量有明显的影响[5]（本文作者亦有研究，另文报道）。同时，甘肃由于气候地理影响，从陇南、定西、兰州、白银到金昌，花期从5月到7月，采期不同，因此，针对影响金银花品质的因素，甘肃各产区必须制定切实可行、可操作的金银花生产技术操作规程（SOP），以保证药材质量。

    金银花是中医临床常用药材和药食兼用植物，已由单一药用向保健食品、饮料、日用化工等领域纵深。同时，世界天然药物需求量逐年以10 ％的速度增长，据中国经济林协会统计，2005年全国金银花年产量800万千克，而国内外市场需求量为2000万千克以上，供需缺口很大，金银花市场前景广阔。甘肃金银花基地应该建立“公司＋农户”生产加工的经营模式，带动广大农民致富。金银花含有的许多生理活性成分以及茎、叶还未得到充分利用，本省应与科研院所合作进行金银花综合利用研究。

【文献】
  [1]国家药典委员会.中国药典（2005年版一部及补充检验方法）[M].北京：化学出版社，2005:58.

[2]徐炳声.金银花的原植物研究[J].药学学报，1979，14（1）：23.

[3]黄西峰.金银花的研究概况及展望[J].中国中药杂志，1997，27（4）：247.

[4]王天志.金银花的研究进展[J].华西药学杂志，2000，15（4）：292.

[5]王桂英，田勤为.金银花的采收加工方法及其成品性状比较[J].中草药，1996，27（4）：233.

[6]中国药材公司.中国中药区划[M].北京：出版社，1995：120.