副溶血性弧菌流行群特异多重PCR鉴定
【摘要】 目的 建立适于基层单位应用的针对副溶血性弧菌流行群的特异多重PCR方法。 方法 查找副溶血性弧菌的基因序列，将当前流行群的序列和以往副溶血性弧菌的序列进行比较，设计针对流行群的PCR引物，并进行多重PCR扩增。结果 运用群特异多重PCR法可特异性的扩增出当前流行群副溶血性弧菌的目的基因片段，可大大缩短鉴定时间。 结论 群特异多重PCR法能快速鉴定当前副溶血性弧菌流行群，有利于流行病学溯源等。
【关键词】 副溶血性弧菌
副溶血性弧菌( Vibrio parahaemolyticus ,Vp)是一种嗜盐性细菌。人由于生吃或食用未煮熟的海产品常引起食源性感染，导致急性胃肠炎〔1〕。副溶血性弧菌可分为13个O血清型和71个K血清型〔2〕，当前流行的副溶血性弧菌以O3:K6、O4:K68和部分O1血清型为主。研究显示，这些血清型别的菌株在基因型别上几乎一致，因此，被称作流行群〔3-5〕。常规检测副溶血性弧菌的方法大多要经过增菌、选择性培养、生化鉴定和血清学反应等过程，操作繁琐、耗时长、检出率低，不利于及时诊断和流行病学溯源。为克服副溶血性弧菌常规检测方法的不足，我们建立了适合基层单位应用的群特异多重PCR方法，以期能进行副溶血性弧菌流行群的快速鉴定和流行病学溯源中发挥积极作用。现将结果报告如下。
1 材料与方法
1?1 菌株 大肠埃希菌1株；金黄色葡萄球菌1株；副溶血性弧菌11株，其中血清型7株，均为O3:K6株，O4:K68株2株，O1：K25株2株。所有菌株均为本中心实验室在食源性监测标本中分离所得。
1?2 多重PCR引物设计 根据副溶血性弧菌耐热直接溶血素基因tdh（Genbank Accession No：D90238）设计针对扩增部分tdh基因片段的引物，P上: 5′-GACTGTGAACATTAATGA-3′， P下: 5′-CGATTCTTTGTTGGATATAC-3′，扩增产物360bp左右。查找副溶血性弧菌的基因序列，将当前流行群的序列和以往副溶血性弧菌的序列进行比较，根据流行群特异的toxRS/new基因（GenBank Accession No：L11929）设计扩增850bp左右的引物，P上: 5′-TAATGAGGTAGAAAC-3′，P下: 5′-CGTAACGGGCCTACA-3′。
1?3 菌株培养和模板DNA提取 菌株复苏后，接种于相应增菌培养基培养18～24h，然后转种至相应的选择培养基培养18～24h。在平板上挑取2～3个单个菌落与100μl灭菌纯水研磨混匀，95℃ 10min，10000r/min离心5min，取上清作为DNA模板。
1?4 多重PCR扩增目的基因和扩增条件优化 分别采用单一引物对扩增相应目的基因片段，进行PCR扩增条件的摸索，接着进行多重PCR扩增条件的筛选和优化。最后采用的多重PCR扩增条件是50μl的PCR反应体系中含10 PCR反应缓冲液5?0μl，25mmol MgCl2 3?0μl，10mmol dNTP 1?0μl，tdh上游引物（25pmol/μl）1?0μl，tdh下游引物（25pmol/μl）1?0μl，toxRS/new上游引物（25pmol/μl）1?0μl，toxRS/new下游引物（25pmol/μl）1?0μl，模板DNA 5?0μl，Taq酶（5U/μl）0?6μl，灭菌双蒸水补足至总体积50μl。将PCR反应体系置于PCR热循环仪上，94℃ 5min；94℃ 30s，45℃ 30s，72℃ 60s共30个循环。最后，72℃延伸10min。
1?5 电泳检测 取5μl PCR产物和1μl 6×上样缓冲液充分混匀置2?0％琼脂糖凝胶〔含溴化乙锭（EB）0?5mg/L〕电泳。电压5v/cm,电流40mA，电泳缓冲液0?5×三乙基硼烷（TBE）。凝胶成像仪观察结果并拍照。
1?6 敏感性试验 从TCBS培养基37℃培养18～24h的副溶血性弧菌中刮取菌落用灭菌双蒸水配成菌悬液,活菌系列稀释菌落计数后,再以灭菌双蒸水对副溶血性弧菌菌株进行10－3～10－8cfu/ml的稀释 ,从各稀释度中取100μl做PCR，进行敏感性评价。
2 结果
2?1 单一引物PCR扩增（图1、图2） tdh基因片段引物能扩增出11株流行群副溶血性弧菌，产物大小约为360bp左右，在图1中，1～11泳道为流行群副溶血性弧菌，有目的条带。而在同一条件下扩增的大肠埃希菌、金黄色葡萄菌均未扩增出目的片段，图1中12和13泳道分别是大肠埃希菌和金葡菌，均未见目的条带；toxRS/new基因同样在11株流行群副溶血性弧菌能扩增出850bp左右的目的片段，而同时参与扩增的大肠埃希菌、金葡菌均未见目的片段。图2中，1～11泳道为流行群副溶血性弧菌，有目的条带。12和13泳道分别是大肠埃希菌和金葡菌，未见目的条带，表明所设计的PCR引物的扩增结果特异性很高。
M：100bp marker；1～7：O3:K6型副溶血性弧菌；8～9：O4:K68型副溶血性弧菌；10～11:O1:K25型副溶血性弧菌；12：大肠埃希菌；13：金黄色葡萄球菌
图1 细菌tdh基因片段的扩增（略）
M：100bp marker；1～7：O3:K6型副溶血性弧菌；8～9：O4:K68型副溶血性弧菌；10～11: O1:K25型副溶血性弧菌；12：大肠埃希菌；13：金黄色葡萄球菌
图2 细菌toxRS/new基因片段的扩增（略）
2?2 多重PCR扩增（图3） 从图3可看出，1～11泳道的 11株流行群副溶血性弧菌均扩增出360bp左右的tdh基因片段和850bp左右的toxRS/new基因片段，12和13泳道的大肠埃希菌和金葡菌都未扩增出任何目的片段，表明此方法用于流行群副溶血性弧菌的快速鉴定特异性较高。
M：100bp marker；1～7：O3:K6型副溶血性弧菌；8～9：O4:K68型副溶血性弧菌；10～11: O1:K25型副溶血性弧菌；12：大肠埃希菌；13：金黄色葡萄球菌
图3 细菌tdh和toxRS/new基因片段的多重扩增（略）
2?3 敏感性 PCR在所作的稀释度中均很好的扩增出了目的条带，敏感性较高。
随着分子生物学技术的，用于副溶血性弧菌鉴定的分子生物学方法亦越来越多。当前用于副溶血性弧菌的鉴定方法就有随机引物PCR〔6〕（APPCR）、实时PCR〔7〕(real-time PCR) 、脉冲场电泳〔8〕 (PFGE)、基因芯片〔9〕等。APPCR容易引起非特异性扩增，而实时PCR 、PFGE和基因芯片方法技术含量高并且设备价格昂贵，因此，均不适于基层单位开展工作。由于当前的副溶血性弧菌食源性感染以流行群为主，并且可致病的多为含有耐热直接溶血素，因此，针对流行群特异的toxRS/new基因和耐热直接溶血素基因tdh设计引物建立副溶血性弧菌当前流行群的多重PCR快速检测方法。多重PCR 并非单一引物对PCR的简单组合,在进行条件摸索时发现，Mg2+、dNTPs、酶的用量以及循环条件等均需进行优化,尤其是DNA链退火温度。适当提高 Mg2＋、dNTPs 的浓度, 能取得较好效果, 酶的用量与单独扩增相似时，效果已很理想，量不宜过大，否则会出现拖带和非特异扩增。可见，该种群特异多重PCR方法简便、快速，同时特异性和敏感性也良好，并且仪器试剂成本低，技术容易掌握，适合基层单位应用。
【】
〔1〕 Jaime Martinez-Urtaza,Antonio Lozano-Leon,Angelo DePaola,et al.Characterization of pathogenic vibrio parahaemolyticus isolates from clinical sources in spain and comparison with asian and north american pandemic isolates［J］.J Clin Microbio,2004,42(10):4672-4678.
〔2〕 Nandini Roy Chowdhury,O Colin Stine,J Glenn Morris,et al.Nair assessment of evolution of pandemic vibrio parahaemolyticus by multilocus sequence typing［J］.J Clin Microbio,2004,42(3):1280-1282.
〔3〕 Tracie L Williams,Steven M Musser,Jessica L Nordstrom,et al.Identification of a protein biomarker unique to the pandemic O3:K6 clone of vibrio parahaemolyticus ［J］.J Clin Microbio,2004,42(4):1657-1665.
〔4〕 Hin-Chung Wong,Chih-Hsueh Lin.Evaluation of typing of vibrio parahaemolyticus by three PCR methods using specific primers［J］.J Clin Microbio,2001, 39(12):4233-4240.
〔5〕 Lee CY,Panicker G,Bej AK.Detection of pathogenic bacteria in shellfish using multiplex PCR followed by covalink NH microwell plate sandwich hybridezation［J］.J Microbiol Methods,2003,53 (2):199-209.
〔6〕 Matsumoto C,Okuda J,Ishibashi M,et al.Pandemic spread of an O3:K6 clone of vibrio parahaemolyticus and emergence of related strains evidenced by arbitrarily primed PCR and toxRS sequence analyses［J］.J Clin Microbio,2000,38 (2):578 - 585.
〔7〕 Blackstone GM,Nordstrom JL,Vickery MC,et al.Detection of pathogenic vibrio parathaemolyticus in oyster entichments by real time PCR［J］.J Microbiol Methods,2003,53 (2):149-155.
〔8〕 S J Peacock,G D I de Silva,A Justice,et al.Day Comparison of multilocus sequence typing and pulsed-field gel electrophoresis as tools for typing staphylococcus aureus isolates in a microepidemiological setting［J］.J Clin Microbio,2002,40(10):3764-3770.
〔9〕 Gooch JA,Depaolar A,Kaysmer CA，et al.Evaluation of two direct plating methods using nonoradio active probes for enumeration of vibrio parahaemolyticus in oysters［J］.Appl and Environ Microbiol，2001,67(2):721-724.
