肿瘤手术切缘的分子边界研究进展

【关键词】  肿瘤手术切缘 分子边界 基因 综述

   目前，手术切除是肿瘤的最主要手段之一，而术后局部复发是手术治疗失败和影响患者预后的重要原因。因此，手术切缘彻底与否成为影响肿瘤预后的主要因素，如何获得安全的手术切缘目前仍存在较大争议。传统方法判断手术切除是否干净主要基于对切缘组织的常规病（即细胞形态学）观察，然而在病理学诊断为切缘阴性［1］的患者中，仍有10％～30％的病例出现了局部的复发［2］。此法的局限性在于：（１）对形态上（或表型上）与正常细胞无可见差异的癌前细胞或具有潜在转化能力的“正常”细胞没有区分能力；（２）当正常细胞中只有少量癌细胞或微癌灶只存在于切缘组织的某个区域时，常规病理学检查不可能对切缘组织全部切片逐片观察，极易造成漏检。

    最近研究表明，肿瘤在细胞形态发生明显变化之前，其分子水平及生化代谢水平方面已发生异常改变，出现功能异常的癌基因产物或产物表达增强。因此，探寻一种更为准确的判定方法，从而明确手术切缘的性质就具有重要的理论价值和临床意义，手术切缘的分子边界（molecular margins）这一概念也就随之产生。所谓肿瘤手术切缘的分子边界，就是利用分子生物学和（或）基因组学的技术方法，检测手术切缘处的一些与肿瘤高度相关的基因或蛋白的表达情况，从而发现阴性切缘处的局部隐匿性癌灶，并根据这些分子标记物的表达情况对肿瘤做出准确的分子定界，更好地判断肿瘤的术后复发和评估肿瘤的预后。随着分子生物学和基因组学研究的不断深入，不但为肿瘤手术切缘的分子边界提供了理论基础，而且为探讨分子边界提供了必要的技术手段，一些可能的分子标记物也随之被提出。现将与肿瘤手术切缘相关的一些分子标记物及其研究现状综述如下。

    1  p53基因

    p53基因是最常见的抑癌基因之一，通过多种途径发挥抑癌作用，被称为维持人类基因组稳定性的分子警察。但是突变型的p53基因不仅促进细胞的生长，还会影响基因组的稳定性而加快细胞恶性变，突变后其表达蛋白的半衰期明显延长，可通过免疫组化方法检出，且其突变几乎见于所有的人类肿瘤中。因此，p53基因就成为判定手术切缘的分子边界最常用的分子标记物之一。

    Huang等［3］对头颈部鳞癌患者术后切缘的黏膜及病灶深处的p53基因突变情况进行了研究并随访后发现，16例常规病理学诊断为切缘阴性，而分子生物学检测p53基因突变的患者中，有11例发生了复发（6９％）。手术切缘p53基因突变阳性患者的局部复发可能性明显较手术切缘无突变者为高（Ｐ＝0.048）；病灶深处分子边界的p53基因突变阳性患者的局部复发可能性明显较黏膜处突变阳性者为高（Ｐ＝0.009）。提示p53基因的突变是导致治疗失败的主要原因，检测其表达情况是分析手术切缘分子边界的重要指标之一。刘君等［4］对48例切缘阴性象限切除标本大切片观察乳腺内原发癌及癌旁病变累犯范围，并对62例全乳腺切除标本采用免疫组化及分子生物学方法，检测癌和癌旁组织p53、PCNA、C?erbB?2等表达情况，分析癌瘤向周边浸润及周围组织癌变趋向的。结果随着距原发癌越远，癌旁发生高危病变，PCNA、C?erbB?2及p53阳性的比例逐渐降低（P＜0.05）；近乳头端和肿瘤两侧癌旁危险因素阳性病变较远侧端范围广泛（P＜0.05）；癌旁不同范围危险因素比例与乳腺原发癌伴有广泛的导管内癌成分（EIC）、C?erbB?2及p53阳性有关（Ｐ＜0.05）。提示对原发癌EIC、C?erbB?2和（或）p53阳性表达者应扩大切除范围，达到切缘阴性，降低局部复发率。

    2  c?Myc

    c?Myc是原癌基因，普遍存在于成人和胚胎的正常组织中，也存在于许多类型的肿瘤组织中，具有促进细胞分裂并获得永生化的功能。c?Myc蛋白的高表达与人类多种恶性肿瘤的发生、有关，可使细胞获得永生化，当与其它活性癌基因协同作用时可致细胞发生恶性转化。检测c?Myc基因和蛋白在手术切缘处的表达情况可更好地估计手术切缘的性质，从而进一步评估切缘阴性患者的预后。

    Yang等［5］利用免疫组化方法检测了104例行根治性前列腺切除术患者标本的c?Myc基因及其下游靶基因caveolin-1的表达情况，结果显示两者的共表达情况可能成为预测人类前列腺癌的有效标记物，且两者在人类前列腺癌的发展过程中共同发挥着重要作用。提示检测c?Myc基因的变化情况对于指导临床治疗和判断疗效有着积极的意义。Geisler等［6］对121例子宫内膜癌患者c?Myc基因表达情况与生存率之间的关系进行了研究后发现，c?Myc基因是估计子宫内膜癌患者生存率的重要因素，且c?Myc蛋白的表达也与患者的生存率密切相关。

    3  CD44

    CD44是一种细胞表面黏附分子，主要参与细胞和细胞、细胞和基质之间的特异性黏附过程，与细胞的运动，肿瘤的发生、浸润和转移密切相关。其基因按外显子的表达方式不同可分为标准构型CD44s（standard form）和变异型CD44v（variant isoform）。应用基因分析手段检测CD44基因在手术切缘处的变化情况对于判断术后效果、评估预后及确立手术切缘的分子边界都具有重要的意义。

    Femandez等［7］研究发现肿瘤组织CD44s水平明显高于肿瘤周边黏膜组织，两种组织的CD44s水平在高S期肿瘤中明显高于低S期肿瘤。肿瘤组织CD44s水平和患者预后无关，然而肿瘤周边非肿瘤黏膜的高CD44s水平和患者预后不良显著相关。提示CD44可能在肿瘤生长中起一定作用，肿瘤周围黏膜的CD44s水平可能成为确立手术切缘分子边界的标志物之一，且在评估肿瘤患者预后中发挥重要作用。Vizoso等［8］报道肿瘤组织和瘤周黏膜组织的CD44v5表达水平无明显差异，但肿瘤组织CD44v6的表达水平比瘤周黏膜显著增高。肿瘤组织中CD44v5或CD44v6表达水平高的肿瘤患者无复发生存期均缩短，CD44v6表达水平高的患者无复发生存期更短。王伟等［9］发现，CD44v6蛋白表达在癌组织与手术切缘区正常组织、癌组织与癌旁组织、癌旁组织与手术切缘区正常组织之间差异均具有显著性。

    4  端粒酶

    端粒酶是一种核糖核蛋白体，具有逆转录酶活性，它能以自身的RNA组分为模板合成端粒，以补偿细胞分裂时染色体端粒的缩短，使得端粒的长度得以维持，细胞染色体形态得到稳定，从而逃避了因端粒缩短而引起的细胞死亡，使细胞获得“永生化”。正常人体细胞很少能检测出端粒酶活性的表达，而100％的肿瘤细胞株及大多数肿瘤组织中的端粒酶活性却异常地表达。端粒酶已被认为是迄今为止最有特异性和敏感性的肿瘤标志物和抗肿瘤治疗的新靶点之一，因此检测其活性和端粒的长度可用于估计癌变的潜能和趋势、观察疗效及预后。

    Botchkina等［10］对60例经外科治疗患者的腹膜上皮细胞端粒酶活性进行了评估，结果发现其中32例是被临床诊断为各种胃肠道肿瘤的，1例是癌前病变的，2例是有胃肠道肿瘤病史的，还有25例是非肿瘤的。各种胃肠道肿瘤的端粒酶均为阳性，证明其在肿瘤中有100％的敏感性；而在25例良性病例中有18例检测不到端粒酶活性，有2例低表达，仅有5例呈高表达的端粒酶活性。正常的上皮细胞与癌细胞相比有较低的端粒酶活性和较小的剥脱可能性，这对于在以后的随访中排除患者恶性病变的可能性具有重要意义。对胃肠道肿瘤患者腹膜上皮细胞的端粒酶活性进行检测具有100％的敏感性和100％的阴性预测价值，是一种有效的检测手段和对标准诊断方法的有益补充。Vidaurreta等［11］研究了端粒酶活性与微卫星不稳性（microsatellite instability，MSI）之间的相关性及其与生存率之间的关系，结果6.2％的结直肠癌患者显示出高微卫星不稳性（MSI?H），10.3％的患者显示出低微卫星不稳性（MSI?L），83.5％的患者没有此改变（MSS）；92.8％的患者检测出端粒酶活性阳性；83.3％的MSI?H肿瘤显示端粒酶阳性，而MSS肿瘤显示端粒酶阳性率为93.8％。在生存率分析方面端粒酶活性的缺失意味着良好的预后。提示经MSI发展而来的肿瘤有着良好的预后，端粒酶阴性肿瘤患者的生存率明显高于端粒酶阳性患者。苏颖等［12］取肝癌手术标本30例，每例均取癌组织、癌旁肝组织及外侧切缘肝组织，采用PCR?ELISA法检测其端粒酶的活性。结果端粒酶阳性率肝癌组织为76.7％（23/30），癌旁组织为16.7％（5/30），外侧切缘肝组织呈现阴性（0/30），肝癌组织与癌旁组织及外侧切缘肝组织端粒酶的表达有显著差异（Ｐ＜0.01），癌旁组织与外侧切缘肝组织端粒酶的表达也有显著差异（Ｐ＜0.05）。提示其作为肝癌切缘诊断和预后判断的分子标志具有一定的价值。

    5  Survivin

    Survivin是凋亡抑制蛋白家族的新成员，它直接作用于凋亡蛋白酶级联通路的终末效应因子Caspase?3和Caspase?7而发挥抗凋亡作用，是迄今发现的最强的凋亡抑制因子。其表达具有高度特异性，在胚胎、发育的胎儿组织和多种肿瘤组织中表达，不见于终末分化的成人组织（胸腺、生殖腺除外）。Survivin的表达情况对于评价术后效果和估计预后具有非常重要的意义。

    Karam等［13］研究发现Survivin在正常膀胱上皮中不表达，而在没有侵犯至肌层的膀胱癌中有53％呈过表达；Survivin的过表达与较高的肿瘤分级相关，还与肿瘤的复发和发展相关；经尿道前列腺切除术和膀胱切除术标本的Survivin表达情况高度一致。结果显示检测经尿道前列腺切除术标本的Survivin表达情况有助于筛选出具有高复发风险的患者，以便对其进行密切的随访或实施更积极的治疗。陈妍等［14］应用免疫组化技术检测47例非小细胞肺癌和10例肺部良性疾病手术切除标本的支气管切缘（切缘病理无癌残留）、病灶组织和正常肺组织中的Survivin表达，并随访了解术后切缘癌复发与癌复发转移情况。结果12例（25.53％）肺癌支气管切缘和28例（59.57％）肺癌组织Survivin阳性表达，正常肺组织和良性病变肺组织Survivin表达均阴性。支气管切缘Survivin阳性组术后随访6～16个月，4例（33.33％）发生支气管残端癌复发，而Survivin阴性组术后无残端癌复发。手术切缘Survivn阳性组与阴性组的5年生存率分别为25.0％和54.29％，肺癌组织中Survivin阳性组与阴性组的5年生存率分别为32.14％和68.42％，差异有统计学意义（P＜0.05）。Yi等［15］以64例35岁以下接受治疗的子宫颈癌患者为研究组，并以90例在同一时期接受过治疗的35岁以上的子宫颈癌患者为参照组，利用免疫组化和定量图像分析同时检测两组中Survivin和p27蛋白的不同表达情况。结果研究组的总体5年生存率为65.6％，参照组为84.4％; 研究组的淋巴结转移率为25％，参照组为12.2％。Survivin在研究组中的表达明显较参照组高，p27的表达与淋巴结转移有关。提示年轻女性患者的预后较年长者差，Survivin的表达与预后不良密切相关。检测以上分子标记物可进一步估计手术切缘情况，且针对其进行相应的治疗可改善年轻女性子宫颈癌患者的预后。

    6  CyclinD1

    CyclinD1属于G1期细胞周期素，通过与细胞周期依赖性蛋白激酶（cyclin dependent kinase）结合促进G1期向S期的转变。CyclinD1在正常增殖细胞中表达处于极低水平，但在人类多种恶性肿瘤中均过度表达，检测其表达情况可发现局部隐匿性病灶，准确判断肿瘤浸润的边界。

    Yang等［16］利用免疫组化方法检测48例胃肠道间质瘤患者的肿瘤部分及正常组织中的CyclinD1和p27的表达情况，结果48例患者中表达CyclinD1和p27蛋白的分别为58.33％和54.16％；CyclinD1和p27蛋白的表达与肿瘤的分化程度和复发密切相关。提示CyclinD1和p27的表达情况与胃肠道间质瘤的发生、发展密切相关，两者可能成为判定胃肠道间质瘤患者疗效和估计预后的重要指标。Lu等［17］采用免疫组化SP法对41例子宫颈癌、17例子宫颈上皮瘤（cervical intraepithelial neoplasia，CIN）和10例正常组织的Survivin、CyclinD1、p21（WAF1）及Caspase?3的表达情况进行了研究，并比较它们与病理分级、临床分期、转移和生存时间的相关性。结果显示子宫颈癌组Survivin和CyclinD1的阳性表达率明显较CIN组和正常组高，Survivin和CyclinD1阳性表达的子宫颈癌患者的平均生存时间较阴性表达者明显缩短，但两者的表达与病理分级、临床分期和转移无关；子宫颈癌组p21（WAF1）和Caspase?3的阳性表达率明显较CIN组和正常组低，且与肿瘤分级密切相关。Survivin在子宫颈癌中的表达与Caspase?3的表达无相关性，但与CyclinD1的表达关系密切，且Survivin可作为一个独立的预后指标影响子宫颈癌患者的生存时间。提示Survivin或CyclinD1的高表达、p21（WAF1）或Caspase?3的低表达与子宫颈癌的发展密切相关，Survivin和CyclinD1可作为预测子宫颈癌预后的有效标志物在指导临床治疗中发挥重要的作用。

    7  Ki?67

    Ki?67是存在于增生细胞核的一种非组蛋白核蛋白,是一种与细胞增殖密切相关的核抗原。Ki?67分布于核内,其功能与染色质相连及与细胞的有丝分裂密切相关, 被认为是较理想的检测细胞增殖活性的指标。Ki?67被广泛应用于研究各种肿瘤患者的细胞增殖活性，以及细胞周期与肿瘤的生长方式、浸润方式、复发、转移等生物学行为及预后的关系。

    Aaltomaa等［18］分析了增殖标记物Ki?67、cyclinD1和凋亡对于经根治性前列腺切除术的前列腺癌患者的预测价值。他们对211例经根治性前列腺切除术治疗的限局性前列腺癌患者进行了平均7.3年的随访，重新分析了这些患者的原始组织病标本，以确定其属于同一组织病理学等级和pT分级，并且利用组织芯片和免疫组化技术检测其Ki?67、cyclinD1和凋亡标志物Tag的表达情况，最后用光显微术分析结果并与普通组织学、pT和临床随访的数据进行比较。结果显示：Ki?67和cyclinD1常共表达；Ki?67阳性细胞的高分数和凋亡细胞的高分数常出现于相同肿瘤中。高凋亡率与阳性外科边界相关；Ki?67低表达与低Gleason分数、无被膜和围神经侵入相关；cyclinD1高表达与围神经生长相关；通过Gleason分级和被膜侵入可以预测前列腺特异性抗原无复发生存率；Ki?67高表达和高凋亡率与肿瘤死亡的高风险相关；经多变量分析精囊侵入是肿瘤死亡的最佳独立预测因子。提示Ki?67、cyclinD1的表达和高凋亡率与前列腺癌的恶性表型密切相关，对于判定手术切缘的性质、指导进一步的临床治疗具有重要意义。Ozaki等［19］评估了外科边界和ki?67、cyclinD1蛋白表达对于肿瘤的预测价值。经研究发现，不完全外科切除组在术后30个月内的复发、转移和死亡率均高于完全外科切除组；不完全外科切除组中ki?67低阳性染色的有非常好的生存率；大部分cyclinD1阳性的有高复发率；不完全切除与高转移率和预后不良相关；ki?67阳性率是预测不完全外科切除组总存活数的标记物之一。

    8   PCNA

    增殖细胞核抗原（proliferating cell nuclear antigen，PCNA）是DNA聚合酶δ的辅助蛋白，参与DNA的合成，与细胞增殖密切相关。细胞增殖是细胞生物学过程中最重要的基础，也是肿瘤生物学行为最主要的特征之一，肿瘤的恶性程度主要是由肿瘤细胞增殖活性决定的。检测肿瘤及其切缘处PCNA的表达情况对于了解肿瘤细胞的增殖状态、正确判断其生物学行为及辅助临床治疗方面具有很高的价值。

    Taftachi等［20］对经根治性前列腺切除术患者的PCNA和Ki-67的表达情况进行分析，并以此评估前列腺肿瘤细胞增殖对于肿瘤的预测价值，结果显示用PCNA或Ki?67估计肿瘤细胞的增殖与肿瘤发展密切相关。PCNA标记指数是肿瘤发展的独立预测因子之一（尤其针对一些已被认为是低发展风险的患者）。提示对术后患者进行该指标的检测有助于对手术效果的判定，并对临床治疗起到一定的指导作用。Oquar等［21］以19例1～15年间发生复发的阴性切缘肿瘤患者为实验组，并以20例经根治性切除术后10年或10年以上均无复发的pT1、pN0浸润性导管癌患者为对照组，对其临床资料、一般肿瘤特征和16个转移相关因子的免疫组化表达情况进行研究，结果MMP?2、MT1?MMP、T1MP?2、VEGF、cMET和PCNA在实验组中明显表达；MMP?9在复发组中明显低表达；在这些因子中MMP?2、MT1?MMP和VEGF显示出最高的调整优势比。提示MMP家族和生长因子有望成为预测早期乳腺癌复发的有效标志物。

    9  MMP

    血管生成是肿瘤恶性转化、生长和转移的生物学基础与重要环节。基质金属蛋白酶（matrix metalloproteinase，MMP）通过降解细胞外基质和基底膜促进血管内皮细胞和肿瘤细胞的迁移与侵袭，是导致肿瘤血管生成的重要因子之一，与肿瘤的侵袭和转移等生物学行为密切相关。MMP的表达情况是判断肿瘤病变发展、预测肿瘤转移潜能的客观指标之一，对肿瘤临床治疗起到了一定的指导作用。

    有研究［9］表明MMP?2蛋白的表达在癌组织与手术切缘区正常组织、癌组织与癌旁组织之间有显著差异；在切缘阴性发生复发的患者中，MMP?2、MT1?MMP明显表达，MMP?9明显低表达［21］。Ajisaka等［22］等用RT?PCR技术检测分析153例胃癌中MMP?7的活性，发现胃癌中MMP?7的活性明显高于临近组织，且其表达强度与肿瘤浸润深度、淋巴结转移和脉管侵犯以及5年生存率密切相关。

    综上所述，恶性肿瘤手术治疗的原则是彻底切除原发病灶，获得阴性切缘。如何确立一个真正安全的手术切缘，对患者的局部复发和预后均起到了关键作用。常规病理学检测出的癌细胞阳性切缘与切缘中仅有分子生物学变化者不同，后者仅有基因改变而无形态学改变，可能处于肿瘤发生的早期阶段，这有可能成为肿瘤复发的根源。对手术患者切缘进行分子生物学检测，确定其手术切缘的分子边界，目的不仅仅是筛选出预后差的患者，更重要的是对这些患者进行及时的干预，以提高其生存率。因此，常规的病理学检查结合分子生物学检测可提高手术切缘诊断的敏感性，对预防患者术后复发和评估预后都具有重要的意义。从分子水平重新评价和确定肿瘤的手术切缘，亟待深入探究。

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