蛋白脂质微粒体Saposin C?dops能增强小鼠免疫功能

             作者：赵树立,赵光锋,路洪娜,祁晓阳,侯亚义

【摘要】  目的：研究新型抗肿瘤药Saposin C?dops对小鼠免疫功能的影响。方法：采用实效药量及其10倍药量的Saposin C?dops给雌性B6小鼠进行连续7 d腹腔注射给药后，检测小鼠脾脏中与肿瘤免疫相关的免疫细胞、血清中的细胞因子和IgG含量的变化，从而判断其在正常药量和超量情况下对健康小鼠免疫力的影响。结果：Saposin C?dops在正常用药量情况下对小鼠免疫功能有显著激活效应，这种激活效应不是剂量依赖的，而且在超量应用的情况下对小鼠免疫功能不产生负面影响。结论：Saposin C?dops具有免疫激活剂的作用，能增强小鼠的免疫功能。

【关键词】  Saposin C?dops； 肿瘤免疫； 免疫激活； 小鼠

    Saposin C?dops(缩写为Sapc?dops)是新近发明的一种具有肿瘤靶向性作用的候选药物，它是由一种鞘脂激活蛋白(sphingolipid activator protein，Saposin)C和二油基磷脂酰丝氨酸（DOPS）组成的蛋白脂质微粒体。Saposin是存在于溶酶体中的一种激活蛋白，包括A、B、C和D 4类成员，这类蛋白都能与细胞膜上的磷脂结构结合［1?4］。其中，Saposin C具有独特的性质，即在酸性条件下，很低浓度(nmol) 的Saposin C即可与细胞膜上的阴离子不饱和磷脂成分融合［5?6］。体内肿瘤细胞生长速度快，需氧量大，二氧化碳排放量也大，致使肿瘤微环境呈酸性［7］。根据Saposin C和肿瘤微环境的特性，我们以往研制的Sapc?dops蛋白脂质微粒体能特异地与肿瘤细胞膜结合，并引起肿瘤细胞膜磷脂双分子层的重新排列，特异性抑制其增殖或杀伤肿瘤（癌）细胞，而不影响正常细胞的生长［8］。有报道，Sapc?dops对50多种人体肿瘤细胞株和多种癌细胞的裸鼠移植瘤具有明显的杀伤和抑制效应，对正常细胞没有不良影响［9?11］。

    不过，许多蛋白脂质微粒体都具有影响免疫功能的作用，Sapc?dops是一种蛋白脂质微粒体，在靶向性杀伤肿瘤细胞的同时，它对机体本身免疫功能的影响尚未见到相关报道。为此，本实验采用健康的B6小鼠，对其予Sapc?dops处理，分析调节性T细胞（Treg细胞）、树突状细胞（DC细胞）、天然杀伤细胞（NK细胞）、CD8+T细胞等以及血清中相关的细胞因子、IgG含量的变化，为Sapc?dops候选药物进入临床实验提供相应的免疫学资料。

    1  材料和方法

    1.1  材料

    1.1.1  实验动物  4～6周龄B6小鼠24只，体重18～22 g，雌性,购自扬州大学比较医学中心。实验进行前,动物在室内至少饲养1周,均用颗粒饲料喂养在(21±2)℃的环境中,自由摄食和饮水。

    1.1.2  试剂  Sapc?dops系江苏常州长吉生物技术开发有限公司研制，CD3?PECY5.5、CD8?RPE、NK1.1?APC、CD11C?PE、CD4?FITC、CD25?APC和FoxP3?PE抗体均购自美国的eBioscience公司，鼠TGF?β、TNF?α、IFN?γ的ELISA检测试剂盒购自美国Biosource公司，鼠血清IgG定量检测试剂盒购自美国Bethyl公司。

    1.2  方法

    1.2.1  动物试验  24只动物分为对照组（PBS组）、正常剂量（20 mg·kg－1·只－1）组及超剂量(200 mg·kg－1·只－1）组3组,每组8只。所需剂量参照我们前期实验的结果。Sapc?dops用灭菌的PBS稀释，每天腹腔注射1次（每组给药体积均为0.1 ml），连续注射1周,每天1次。

    1.2.2  血清收集  小鼠眼眶采血，4 ℃静置过夜后，3 500 r·min－1离心15 min，取血清，分装，-20 ℃保存。

    1.2.3  脾脏细胞的分离［12］  小鼠眼眶采血后脱颈椎处死，放入75%的酒精灭菌10 min，在超净工作台内取小鼠脾脏，用镊子拉碎，200目筛网过滤,注射器反复推拉以便打散细胞，离心（4 ℃，1 500 r·min－1，5 min）,加入ACK红细胞裂解液处理后，室温静置5 min，离心(4 ℃，1 500 r·min－1,5 min)，再用5 ml预冷的PBS洗涤2次。

    1.2.4  流式细胞术检测脾脏中各免疫细胞的成分［13］   脾脏细胞离心后用1 ml PBS重悬，取80 μl按照说明书分别加入相应的标记抗体，NK细胞用CD3?PECY5.5/NK1.1?APC抗体，DC细胞用CD11C?PE抗体，T细胞用CD3?PECY5.5/CD8?RPE，Treg细胞用CD4?FITC、CD25?APC和FoxP3?PE抗体室温静置30 min，用400 μl 1％的多聚甲醛固定，然后用流式细胞仪检测每组小鼠中各免疫细胞在脾脏总细胞中的比例。

    1.2.5  血清中TGF?β、TNF?α和IFN?γ细胞因子以及IgG含量的测定  按照试剂盒检测说明书检测，每个样品设复孔。根据各标准品浓度梯度的A值绘制标准曲线，根据各个样品的A值，在标准曲线上得出相应的浓度值。

    1.2.6  统计学处理  所有实验数据以x-±s表示,采用t检验，以P<0.05 为差异有显著性意义。所有流式标本均用CellQuest 软件分析。

    2  结    果

    2.1  Sapc?dops能提高DC、NK和CD8+T细胞的数量

    见图1。与对照组比较，正常剂量组和超剂量组中脾脏CD4+CD25+FOXP3+的Treg细胞比例保持不变；而脾脏CD11C+的DC细胞和CD3+NK1.1+的NK细胞在正常剂量组和超剂量组中的比例都比对照组中的明显升高（均P<0.05），其中正常剂量组的NK细胞升高更显著（P<0.01）；正常剂量组脾脏CD8+T细胞所占比例也比对照组明显升高(P<0.05)，而在超剂量组略降低，但不具有统计学意义。结果提示，在一定的浓度范围内，Sapc?dops可能激活DC、NK和CD8+T细胞，改善机体摄取肿瘤抗原和杀伤肿瘤细胞的功能。

    2.2  Sapc?dops对IFN?γ、TNF?α和TGF?β的影响

    与对照组比较，正常剂量组和超剂量组小鼠血清中IFN?γ和TNF?α的表达均有显著升高（P<0.05）；而血清中TGF?β的表达水平基本维持正常不变（表1）。结果提示，Sapc?dops能够提高IFN?γ和TNF?α的表达水平，可能提高机体的抗肿瘤免疫功能。 表1  各组间血清中细胞因子水平的比较1）与对照组比较，P<0.05

    2.3  Sapc?dops对小鼠血清中IgG产生的影响

    与对照组相比，正常剂量组和超剂量组小鼠血清中IgG的含量明显升高，其中超剂量组与对照相之间存在显著统计学差异（P<0.05），但超剂量组与正常剂量组之间无统计学差异（P>0.05），见图2。

    3  讨    论

    Sapc?dops作为一种独特的脂质体生物肽结构类药物，一方面具有一些独特的特性，如高稳定性（高温和蛋白酶均不能使其降解）、弱抗原性（在人、小鼠、狗等实验动物体内基本不引起特异的免疫应答）及强专一性（这种新型脂质体及生物肽对细胞有很强的专一性）［14?15］，而且为了进一步排除药物本身抗原性的影响，我们于首次给药后7 d取样，所以实验结果中血清IgG、CD8+T细胞等获得性免疫功能的升高不是该药特异性引起的。另一方面，该药进入机体后可以改变被包封药物的体内分布，使药物主要分布在肝、脾、肺等器官中，而心、肾、胃肠道药物含量较少［16?17］，这是我们首选脾脏器官来分析其对免疫细胞影响的原因。

    本试验采用了Sapc?dops小鼠体内的有效药物浓度（20 mg·kg－1）和其10倍的药物浓度（200 mg·kg－1）对B6小鼠连续给药，观察该药在正常剂量和超剂量时对正常小鼠免疫系统的影响。实验结果表明，Sapc?dops可以刺激脾脏中DC、NK、CD8+T细胞增殖，激活它们分泌相应的细胞因子IFN?γ和TNF?α，增强体内浆细胞分泌IgG类抗体的能力，而不影响在免疫系统中起重要调节作用的Treg细胞和调节细胞分化、生长的重要因子TGF?β。Sapc?dops对小鼠机体的免疫激活作用不会因为用药量的增加而改变，虽然当用超剂量（200 mg·kg－1）Sapc?dops时对CD8+T细胞的激活作用又降低，但这并不表明该浓度对机体CD8+T细胞有杀伤作用，因为与对照组相比，CD8+T细胞并没有降低，这可能系在该浓度时有一些其它未知机制抑制了该药对CD8+T细胞的激活效应，这尚待进一步研究。

    Treg细胞介导的免疫抑制是一个主要的肿瘤免疫逃逸机制，它能够下调CD4+Th的可诱导共刺激分子（ICOS）的表达,从而减少抗体的产生；直接作用于B细胞阻止其成熟和诱导B细胞的凋亡；还可以阻断DC、NK细胞的成熟；同时分泌TGF?β而促进肿瘤的发生与。本实验证实，Sapc?dops由于其独特的脂质体结构，发挥其免疫佐剂的作用，激发NK、DC、CD8+T细胞增殖，刺激IFN?γ和TNF?α的产生，充分发挥机体自身的免疫功能，从而抑制肿瘤的发生发展。

    自从1974年Allison和Gregoriadis首次证实脂质体能够增强机体对白喉类毒素的体液免疫应答以来，脂质体作为激活免疫系统的佐剂受到国内外学者的广泛关注［18］。虽然近30年来，脂质体一直被用于抗原递呈载体，但由于仍未完全了解其作为免疫佐剂的作用机制，所以目前的试验大部分是经验性的，迄今为止还没有描述脂质体佐剂在体内具体效应的统一模式，对Sapc?dops在体内具体的免疫激活机制还需要进一步研究。

【】
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