丙型肝炎病毒不同编码区His融合抗原的表达与纯化

             作者：韩振格，乔伟振，张敏，孙艳雯，董晨，孟继鸿 

【摘要】  目的：表达和纯化丙型肝炎病毒（HCV）?Core、NS3和NS4的His融合抗原H?C、H?NS3和H?NS4，并初步探讨其在抗体检测中的应用。方法：用重组基因工程技术，构建3种重组质粒C?pET?28a?c(+)、NS3?pET?28a?c(+)和NS4?pET?28a?c(+)以及相应的工程菌；质粒经双酶切、PCR和测序鉴定正确后，IPTG诱导抗原表达，从IPTG使用浓度、诱导温度与时间3个方面优化抗原表达条件；用NTA柱纯化抗原后，分别用单片段重组抗原和混合抗原以酶联免疫吸附试验（ELISA）检测100份HCV抗体阳性血清和40份健康人血清。结果：用单片段重组抗原和混合抗原检测的100份HCV抗体阳性血清中，H?C、H?NS3和H?NS4的抗体阳性率分别为91%、75%和52%，而H?C、H?NS3和H?NS4混合抗原的抗体检出率为100%；检测40份健康人血清，结果全部为阴性。结论：HCV不同编码区单片段His融合抗原具有不同的抗体检出率，但均低于混合抗原的阳性率；在开发HCV抗体诊断试剂时，应采用HCV混合抗原。

【关键词】  丙型肝炎病毒； His融合抗原； 抗原纯化； 表达

    常用的HCV感染诊断方法主要是用ELISA检测抗?HCV。目前，国内外HCV抗体检测试剂均已开发了3代产品，其包被抗原大多采用基因工程抗原［1?2］，主要包括HCV?Core、NS3和NS4。虽然现在普遍应用的第3代ELISA检测试剂的质量较前两代有了很大提高［3］，但仍存在一定程度的假阳性和漏检［4?8］，如何提高HCV抗体ELISA检测试剂的质量是一个亟待解决的问题。而探索和开发更好的HCV抗原，是完善抗体检测试剂盒的关键。我们在以往研究HCV重组抗原［9?10］的基础上，应用基因工程的方法，表达和纯化HCV His融合抗原H?C、H?NS3和H?NS4，用血清学方法对其抗原性进行了初步鉴定，为进一步研制高质量的HCV抗体检测试剂奠定基础。

    1  材料和方法

    1.1  重组质粒的构建与鉴定

    以3种重组质粒C?pGEX?4T?2、NS3?pGEX?4T?2和NS4?pGEX?4T?2（美国CDC惠赠）为模板，分别用PCR方法扩增HCV结构与非结构区基因Core、NS3和NS4。PCR扩增条件：94 ℃预变性2 min；然后92 ℃变性45 s，54 ℃退火45 s，72 ℃延伸1 min 30 s，共35个循环；最后一个循环结束后延伸8 min。

    PCR产物用3S Spin DNA Agarose Gel Purification Kit（上海申能博彩生物科技有限公司）回收。质粒载体pET?28a?c(+) 和PCR产物分别用BamHⅠ和XhoⅠ酶切；将酶切后的3种PCR产物分别与酶切后的质粒载体pET?28a?c(+) 连接；取5 μl连接产物转化100 μl大肠杆菌DH5α感受态细胞，取100 μl菌液涂布于含硫酸卡那霉素（K+）的LB培养基平板，涂匀后置37 ℃培养过夜。挑取能在 K+LB 培养基上生长的菌落接种K+LB液体培养基，37 ℃震荡培养过夜。用WizardTM Plus Minipreps DNA Purification Systems （Promega）抽提质粒。重组质粒经PCR、双酶切、测序进行鉴定。

    1.2  His融合抗原的诱导表达

    将鉴定正确的重组质粒[C?pET?28a?c(+)、NS3?pET?28a?c(+)、NS4?pET?28a?c(+)]分别转化大肠杆菌BL21感受态细菌。取100 μl菌液涂布于K+LB培养基平板，涂匀后置37 ℃培养过夜。

    挑取在K+LB培养基上生长的菌落接种K+LB液体培养基，37 ℃震荡培养过夜，次日转1 ml过夜培养菌液至100 ml K+LB液体培养基，37 ℃摇床继续培养至OD600 nm=0.6，平均分入5支已高压灭菌的50 ml大试管，再加入IPTG(Sigma) 至终浓度分别为0.2、0.4、0.6、0.8及1.0 mmol·L－1，37 ℃继续培养1 h，收集细菌沉淀，SDS/PAGE确定抗原表达量较高时所需较低的IPTG浓度（即适宜诱导剂浓度）；用此浓度IPTG，分别在25、28、30、35及37 ℃ 诱导抗原表达的收集细菌沉淀，SDS/PAGE确定抗原表达量较高时的适宜诱导温度；用适宜IPTG浓度，在适宜的诱导温度下诱导抗原表达0.5、1、1.5、2及3 h，收集细菌沉淀，超声裂解细菌，4 ℃ 10 000 r·min－1离心15 min，分别收集细菌裂解上清和沉淀，SDS/PAGE确定适宜诱导表达时间，了解抗原的表达方式（可溶性/包涵体），初步制定抗原纯化方案。

    1.3   His融合抗原纯化

    在优化的表达条件下扩大细菌培养，诱导抗原表达，收集细菌沉淀。用50 mmol·L－1 Tris?HCl（pH 8.0）缓冲液（含有1 mg·ml－1溶菌酶、0.2% 脱氧胆酸钠和1 mmol·L－1 PMSF）重悬细菌沉淀，室温放置10 min，超声裂解细菌，裂解后的菌液15 000 r·min－1 4 ℃ 离心30 min，备用。

    可溶性抗原纯化：（1）将 NTA树脂（上海申能博彩科技有限公司）装入合适的层析柱，用10倍NTA柱体积的缓冲液A（pH 8.0，50 mmol·L－1 Tris?HCl 缓冲液）清洗树脂；（2）把细菌裂解上清加到NTA层析柱中，流速控制在15 ml·h－1左右，收集漏过部分，用于SDS/PAGE分析蛋白质的结合情况；（3）层析柱用5倍柱体积的缓冲液B（用缓冲液A配成5 mmol·L－1 咪唑溶液，pH 8.0）冲洗树脂，流速控制在30 ml·h－1左右；（4）用1.5倍柱体积的缓冲液C（用缓冲液A配成50 mmol·L－1 咪唑溶液，pH 8.0）洗脱两次，流速控制在15 ml·h－1左右，收集洗脱液；再用1.5倍柱体积缓冲液D（用缓冲液A配成80 mmol·L－1咪唑溶液，pH 8.0）洗脱3次，收集洗脱液；（5）用SDS/PAGE确定目的抗原在洗脱液中的分布情况。

    包涵体变性纯化：超声裂解后的菌液15 000 r·min－1 4 ℃离心15 min后，弃上清，用缓冲液A配制1 mol·L－1尿素溶液（pH 8.0），洗涤沉淀两次；再用缓冲液A配制8 mol·L－1尿素溶液（pH 8.0），重悬沉淀，室温作用1 h，15 000 r·min－1 4 ℃ 离心30 min，收集上清用于变性包涵体抗原的纯化。包涵体抗原的变性纯化步骤与可溶性抗原相同，但纯化过程中使用的缓冲液A，均换为用缓冲液A配制的8 mol·L－1尿素溶液（pH 8.0），其它试剂含量完全相同。

    纯化抗原的浓度测定：用蛋白定量试剂盒 (Coomassie Plus?The Better BradfordTM Assay Kit，PIERCE) 对这3种HCV重组抗原蛋白定量（严格按试剂盒的操作步骤进行）。

    1.4  抗原性检测

    以单片段重组抗原和混合抗原（3种抗原等摩尔混合）检测临床上收集的100份抗?HCV 抗体阳性血清和40份健康人血清，具体检测步骤为：分别将纯化后的H?C、H?NS3、H?NS4抗原和混合抗原用0.05 mol·L－1碳酸盐缓冲液（pH 9.6）稀释，包被酶标板100 μl·孔－1，4 ℃冰箱放置过夜，用1×PBST洗涤3次；加入HRP标记的羊抗人IgG (Sigma) 100 μl·孔－1，震荡混匀，37 ℃孵育30 min，以1×PBST洗涤5次；分别加入OPD底物液A、B各50 μl·孔－1，显色10 min后，用2 mol·L－1 H2SO4溶液50 μl·孔－1终止反应，用BIO?RAD酶标仪测量 A450 nm/A620 nm。结果判断：待测标本孔A450 nm/A620 nm与阴性对照孔平均A450 nm/A620 nm的值(P/N)，P/N≥2.1为阳性［11］。

    2  结    果

    2.1  HCV不同编码区目的基因片段扩增

    分别以重组质粒C?pGEX?4T?2、NS3?pGEX?4T?2、NS4?pGEX?4T?2为模板，扩增目的基因Core、NS3 和NS4片段，PCR扩增基因片段大小分别为：C360 bp,NS3804 bp,NS41 059 bp。PCR扩增目的基因片段大小与预测相近（图1）。

    2.2  重组质粒鉴定

    构建成功的重组质粒C?pET?28a?c(+)、NS3?pET?28a?c(+)、NS4?pET?28a?c(+)分别用BamHⅠ和XhoⅠ双酶切鉴定、PCR鉴定和测序鉴定（上海博亚生物科技有限公司）。鉴定结果：插入的目的基因片段大小及读码框架完全正确。

    2.3  HCV重组抗原的表达与纯化

    3种重组抗原在大肠杆菌BL21中均能表达（图2），其中H?NS3 抗原主要分布在细菌裂解上清液中，是可溶性表达的，而H?C、H?NS4抗原主要分布在细菌裂解沉淀当中，是以包涵体形式表达的。抗原H?NS3最适宜表达条件：37 ℃，IPTG终浓度为1 mmol·L－1，诱导2 h；抗原H?C表达条件：30 ℃，IPTG终浓度为0.5 mmol·L－1，诱导1 h；抗原H?NS4表达条件：25 ℃，IPTG终浓度为0.2 mmol·L－1，诱导2 h。可溶性表达的H?NS3 抗原可以直接经NTA柱来纯化，而H?C、H?NS4 抗原采用尿素变性包涵体的方法纯化。SDS?PAGE结果显示，抗原纯化后没有明显杂蛋白条带，抗原纯度较高（图2）。纯化抗原经蛋白定量测定，浓度分别为：H?C 1.35 mg·ml－1（尿素变性）；H?NS3 1.14 mg·ml－1；H?NS4 3.28 mg·ml－1（尿素变性）。

    2.4  抗原性检测

    用单片段重组抗原检测临床上收集的100份HCV抗体阳性血清，抗体阳性检出率从高至低依次为H?C 91%（91/100）、H?NS3 75%（75/100）和H?NS4 52% （52/100）；其中可被3种单片段抗原H?C、H?NS3、H?NS4同时检出的血清标本有41份(阳性率为41%)，可被抗原H?C和H?NS3同时检出的有28份(阳性率为28%)，可被抗原H?C和H?NS4同时检出的有8份(阳性率为8%)；此外，还分别检测到14份血清单独与抗原H?C呈阳性反应，6份血清单独与 H?NS3抗原呈阳性反应，3份血清单独与H?NS4抗原呈阳性反应。用混合抗原ELISA同样检测这100份血清，检测结果全部为阳性。分别用单片段重组抗原和混合抗原ELISA检测40份健康人血清，检测结果全部为阴性。

    3  讨    论

    HCV是一种高度异质性的RNA病毒，不同地区HCV流行毒株的基因型不同，甚至同一病人在疾病的不同时期，HCV核苷酸序列和氨基酸序列都有很大的差异。近年来许多学者［12?13］通过对HCV基因分型的研究发现，目前在国内流行的HCV毒株主要是1b、2a 亚型，但同时散在有1a、2c、3a和3b等亚型和某些混合感染。

    HCV的高度变异，严重影响了对HCV感染诊断、和预防的研究。Dow等［14］发现1型的NS4抗原对于2、3型抗?HCV抗体检测缺乏敏感性，因此考虑在检测试剂中加入其它型特异性NS4优势抗原组分。但是由于抗原板吸附抗原的量有限，如果不同抗原的加入组合不合适，会导致部分抗原表位不能被充分暴露，从而降低检出率。本实验采用的HCV不同编码区基因片段中，Core、NS3片段来自HCV第1基因型，NS4片段由HCV第1～5基因型的17个NS4优势抗原片段连接而成［15］。实验结果显示，NS4抗原对100份HCV抗体阳性血清有52 份血清具有反应性，并检出8份血清与H?C和H?NS4抗原同时具有反应性，另外还有3份血清单独与H?NS4抗原呈阳性反应。Chang等［15］在研究人工NS4嵌合抗原时发现，嵌合抗原的应用可以提高抗体检测的特异性和敏感性。

    本实验选取质粒pET?28a?c(+)为抗原的表达载体。PET表达体系能在目的抗原分子末端融合6个组氨酸分子，表达抗原能借助组氨酸分子与Ni2+螯合柱紧紧结合的能力在一般或变性（如8 mol·L-1尿素）条件下，用适当浓度咪唑洗脱进行纯化。而现今应用的国产试剂大多采用GST融合抗原，GST的相对分子质量为26 000，远远大于组氨酸分子。组氨酸分子很小，它对目的抗原的影响几乎可以忽略不计［16］，且抗原纯化成本低廉。

    通过对单片段抗原的研究显示，HCV感染过程中，由于HCV感染人体后机体所处的免疫状态和感染阶段不同，各区段抗体可以全部、部分或单独出现。张琳伟等［17］将HCV抗体阳性患者分成急性感染组、慢性感染组、无症状携带病毒组及HCV相关肝癌组进行研究，发现不同组血清中各抗原片段抗体的阳性率差异较大，其中单片段H?C抗体的检出率为17.65%～93.44%，单片段H?NS3抗体的检出率为76.47%～89.47%，单片段H?NS4抗体的检出率为38.89%～96.49%。本实验检测100份HCV抗体阳性血清中，H?C、H?NS3和H?NS4抗体阳性率分别为91%、75%和52%，与之相吻合。这一现象表明HCV结构区和非结构区的每一片段抗原都有着不同的血清学诊断意义，其中H?C抗原的抗原性是最强的，可诱发多数感染者在感染早期产生抗核心抗体，且持续时间长。C抗原和NS3抗原是目前抗?HCV抗体ELISA试剂中的核心成分。由于单片段抗原难以检出所有的抗体阳性血清，所以在研制HCV抗体诊断试剂时，应考虑将来自HCV不同编码区的抗原片段同时加入。

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