基于琼脂糖膜为载体的抗体芯片工作条件的优化

              作者：朱颖，吕林莉，陆祖宏，刘必成  

【摘要】  目的：优化以琼脂糖修饰的玻片为载体的抗体微阵列的制备方法，提高微阵列信噪比及检测灵敏度。方法：选取单核细胞趋化蛋白1（MCP-1）作为待检的靶蛋白，在琼脂糖膜上首先固定MCP-1捕获抗体，经过洗涤、封闭，然后依次加入标准抗原、生物素标记的检测抗体以及亲和素标记的cy3，分别孵育、洗涤后，激光共聚焦扫描仪扫描获取图像，分析各点的荧光强度，根据荧光强度确定捕获抗体的最佳固定时间、温度以及最适宜的洗涤缓冲液。结果：与4、37 ℃过夜固定相比，捕获抗体室温(25 ℃左右)过夜固定时，蛋白质在载体上的固定效率和反应活性最高；捕获抗体过夜固定比固定2 h获得更高的检测灵敏度；另外，通过比较相同pH值不同溶质缓冲液的洗涤效应，pH 7.4的缓冲液PBST可获得更优信号强度。结论：本研究优化了以琼脂糖修饰的玻片为载体的蛋白质微阵列的反应条件，提高了微阵列的检测灵敏度。

【关键词】  抗体芯片； 琼脂糖； 玻片； 灵敏度； 洗涤缓冲液； 固定时间； 固定温度

    抗体芯片又称抗体微阵列(antibody microarray, ABM)，作为蛋白质芯片的一种，是为满足蛋白组学研究的需要在基因芯片的基础上起来的生物芯片家族的新成员［1］。芯片上固定的是特异性抗体，可以通过特异性免疫反应捕获待测样品中的抗原，具有高通量、高特异性及平行性分析的优点，目前已被应用到许多领域［2］。但是蛋白组学本身的复杂性决定了针对蛋白组学的检测技术必然面临很多的挑战，如对检测蛋白的通量、检测动力学范围和检测低限等。由于生物样品尤其是临床标本中与疾病密切相关的蛋白质丰度往往很低，为了实现抗体芯片在生物学研究中的应用，需要对实验流程的每一个步骤进行优化，从而使得灵敏度得到提高。

    本研究旨在通过比较抗体芯片构建过程中的基本实验条件，优化以琼脂糖修饰的玻片为载体的抗体微阵列的制备。我们在过去的实验基础上，比较了反应过程中不同洗涤缓冲液，以及捕获抗体固定时间、温度等实验条件对信号强度、信噪比的影响。

    1  材料与方法

    1.1  试剂与仪器

    单核细胞趋化蛋白1（monocyte chemoattractant protein 1，MCP-1）抗体对和标准抗原购自BD-PharMingen公司，链酶亲和素-cy3购自Zymed公司，小牛血清白蛋白(bovine serium albumin，BSA)和琼脂糖购自Sigma公司，Milli-Q超纯水仪购自Millipore公司，其他试剂购自上海试剂厂；点样仪PixSys 5500 arrayer购自Packard Bioscience公司，激光共聚焦芯片扫描仪Lux-ScanTM-10K(A)及图像分析软件Spot Data Pro 2.0均购自博奥公司。

    1.2  方法

    1.2.1  载体的制备  超纯水配制1%琼脂糖溶液，微波炉煮沸至完全溶解；将3 ml左右琼脂糖溶液覆盖至预热的清洁玻片上，室温凝固后置37 ℃烤箱烘干，置室温保存备用。

    1.2.2  载体的活化  在下一步点样前，琼脂糖膜玻片置于20 mmol·L-1 NaIO4溶液中室温下活化30 min。接着0.01 mmol·L-1 pH 7.4 PBS洗涤5 min×3次，氮气流吹干后立即点样。

    1.2.3  点样  靶标蛋白经点样缓冲液（0.01 mol·L-1 PBS溶液，pH 7.4，含甘油200 ml·L-1）以一定浓度比分别稀释，置点样板孔。按预先设计的阵列用点样仪进行机器点样,如图1所示。点样后玻片置湿盒密封，分别以不同温度、不同时间固定。

    每张玻片点10个相同的亚阵列，每个样品均重复4次。自上而下5个样品随实验目的不同有所区别，常用的样品自上而下分别是链酶亲和素-cy3（阳性控制）、2个倍比稀释的MCP-1捕获抗体（Cap-Ab1、Cap-Ab2浓度分别为250、125 μg·ml-1）、200 μg·ml-1 BSA（阴性控制）、生物素标记的检测抗体（另一个阳性控制）。

    图1  抗体微阵列点样布局

    Fig 1  Schematic layout of antibody microarray

    1.2.4  基于微阵列的免疫分析  （1）非特异性结合位点的封闭：2% BSA/PBS，37 ℃恒温水浴封闭2 h；（2）PBST洗涤5 min×3次，氮气吹干；（3）对同一玻片不同亚阵列覆盖适量不同浓度抗原溶液或待测标本（每个阵列4 μl），注意避免不同阵列间的液体融合，置密闭湿盒，37 ℃恒温水浴；（4）PBST洗涤5 min×4次，氮气吹干；（5）对同一玻片不同亚阵列覆盖适量检测抗体［加量及注意事项同（3）］，置密闭湿盒，37 ℃恒温水浴反应1 h；（6）PBST洗涤5 min×5次，氮气吹干；（7）对同一玻片不同亚阵列覆盖适量链酶亲和素-cy3, 置密闭湿盒，37 ℃恒温水浴反应20 min；（8）PBST洗涤5 min×6次，氮气吹干。

    1.2.5  图像扫描与数据分析  激光共聚焦扫描仪扫描(扫描参数：激光功率80%，光电倍增系数PMT 75%)，保存图片，行荧光强度数据分析。所选择的信号点圆形区域以外信号值作为背景值，最终信号强度（final spot intensities）为信号值（original intensities）减去背景值且为4个重复点的平均值。不同阵列之间的信号值之间的比较采用与各阵列阳性控制标准化后（特异性信号点/阳性控制点）的相对信号强度（relative signal intensity），以排除位置效应。

    2  结    果

    2.1  捕获抗体固定温度对信号强度的影响

    MCP-1捕获抗体用点样缓冲液稀释至250、125 μg·ml-1，按图1所示微阵列布局进行点样，分别比较捕获抗体在4、25、37 ℃过夜固定时系统信号强度的变化。结果（图2）显示，捕获抗体室温(25 ℃左右)过夜固定时，蛋白质在载体上的固定效率和反应活性最高。

    2.2  捕获抗体固定时间对信号强度的影响

    比较两种固定时间对本系统信号强度的影响。点样布局同上，每个样品仍重复4次，数据分析采用其平均值。结果（图3）显示，在不同捕获抗体浓度，过夜固定得到的信号强度（图3B）均高于2 h（图3A）的信号强度。

    2.3  相同pH值不同组成成分的洗涤缓冲液对信号强度的影响

    MCP-1捕获抗体用点样缓冲液稀释后点样固定，其他条件保持一致，分别比较pH  7.4的两种洗涤缓冲液PBST和TBST对系统信号强度以及信噪比的影响。结果（图4）显示，在不同浓度抗原孵育时，PBST洗涤缓冲液系统信号强度（图4A）及信噪比（图4B）均强于TBST系统，且对高浓度抗原阵列信号影响更为明显。

    3  讨    论

    抗体芯片作为一种新型的蛋白质芯片,在其过程中有芯片表面的修饰、检测技术及靶标、探针的选择三大关系密切的支撑技术，其中表面的修饰起着举足轻重的作用［3］。之前我们的研究小组已经建立了以琼脂糖膜为载体的抗体芯片，像所有具有三维结构的载体一样，琼脂糖膜可以提供更好的水化环境，防止蛋白质样品的变性失活。我们已经证明了它比氨基、醛基片具有更高的蛋白承载能力［4-5］，但是蛋白组学本身的复杂性决定了针对蛋白组学的检测技术必然面临很多的挑战。其中,提高系统检测灵敏度是抗体芯片构建过程中所面临的重要挑战之一。

    在既往的研究中，应用最多的是通过完善检测系统来提高灵敏度。譬如，有人使用质谱技术（mass spectrometry，MS)去检测蛋白，不仅灵敏度高，且不需要对目标蛋白进行特殊处理，从而保证了蛋白的活性 ［6］。另外，近年来备受关注的是在检测系统的基础上添加信号放大系统，如结合滚环扩增技术（rolling circle amplification，RCA)或者酪胺酰胺信号放大系统（tyramid signal amplification，TSA)，可明显地提高检测的灵敏度，理论上可达飞摩尔（femtomolar）数量级［7-8］。但是这些方法往往要求使用复杂的仪器设备或者繁复的操作流程，难免会影响实验的可重复性，限制了它们的实用性。而本实验旨在通过比较抗体芯片构建过程中的基本实验条件，优化以琼脂糖修饰的玻片为载体的抗体微阵列的制备。我们比较了捕获抗体的固定时间、温度及洗涤缓冲液的种类等因素,得到了最佳的工作条件，从而进一步优化了系统性能。

    另外，随着人们对芯片技术研究的深入，以及领域多学科的不断交叉、渗透，抗体芯片的制作过程将不断得到完善。近几年的研究热点多与交叉技术的应用相关，如融合纳米生物技术，用纳米颗粒作为标记探针的载体，灵敏度相对于传统ELISA可提高百万倍［9］。

【】
  ［1］PERLEE L, CHRISTIANSEN J, DONDERO R,et al. Development and standardization of multiplexed antibody microarrays for use in quantitative proteomics［J］. Proteome Sci,2004, 2(1):9.

［2］INGVARSSON J, LINDSTEDT M, BORREBAECK C A,et al. One-step fractionation of complex proteomes enables detection of low abundant analytes using antibody-based microarrays［J］. J Proteome Res,2006,5(1):170-176.

［3］TOMIZAKI K Y, USUI K, MIHARA H. Protein-detecting microarrays: current accomplishments and requirements［J］. Chembiochem,2005,6(5):782-799.

［4］金世辉,刘必成,张春秀，等.蛋白质微阵列生产用琼脂糖修饰玻片制备的条件优化［J］.生物工程杂志,2005,2: 57-60.

［5］L? L L, LIU B C, ZHANG C X,et al. Construction of an antibody microarray based on agarose-coated slides［J］. Electrophoresis,2007,28(3):406-413.

［6］ESPINA V, WOODHOUSE E C, WULFKUHLE J,et al. Protein microarray detection strategies: focus on direct detection technologies［J］. J Immunol Methods,2004, 290(1-2):121-133.

［7］WOODBURY R L, VARNUM S M, ZANGAR R C. Elevated HGF levels in sera from breast cancer patients detected using a protein microarray ELISA［J］. J Proteome Res, 2002, 1(3):233-237.

［8］KINGSMORE S F, PATEL D D. Multiplexed protein profiling on antibody-based microarrays by rolling circle amplification［J］. Curr Opin Biotechnol,2003,14(1):74-81.

［9］NIELSEN U B, GEIERSTANGER B H. Multiplexed sandwich assays in microarray format［J］. J Immunol Methods, 2004,290(1-2):107-120.