体外电脉冲刺激对糖尿病膀胱大鼠排尿功能的影响

         作者：宋涛，卫中庆，邓湘蕾，易超然，王欢，陆璐 

【摘要】  目的：探讨体外电刺激法对糖尿病膀胱大鼠排尿功能的影响。方法:将SD大鼠随机分为正常对照组、糖尿病对照组和糖尿病电刺激组3组,每组10只，后两组制作糖尿病大鼠膀胱模型。10周后，电刺激组予体外电刺激，刺激参数：强度31V，密度31Hz，另两组均不予电刺激。持续治疗3周后观察比较各组尿动力学改变及逼尿肌肌条收缩功能变化。结果:糖尿病大鼠造模10周后施加体外电刺激，其膀胱收缩力加强，残余尿量比（R%）有所下降，膀胱排尿阈容量减少，差异均有统计学意义。结论:体外电刺激可改善糖尿病膀胱的逼尿肌收缩能力及膀胱的感觉功能。

【关键词】  体外电脉冲刺激；糖尿病膀胱；尿动力学；大鼠

    糖尿病膀胱病(diabetic cystopathy,DCP) 属于神经源性膀胱尿道功能障碍。作为糖尿病（DM）引起的泌尿系统并发症,其发生率占DM患者的50%左右［1］，而其具体发病机制目前尚不完全清楚。近年的研究表明，除了逼尿肌自身的肌源性功能异常,支配膀胱的外周神经性病变也是其致病机制之一。目前各种体内的电刺激已经逐步应用于治疗神经源性的膀胱功能障碍［2］，但使用体表电刺激技术治疗DCP报道甚少，且尚无其尿动力学及机制方面的研究。本研究通过制作DM膀胱大鼠模型，应用体外电刺激法治疗，3周后观察其对DM大鼠膀胱功能的影响，并探讨其可能的治疗机制。

    1  材料和方法

    1.1  大鼠分组及DM模型建立

    SD雄性大鼠（南京军区总实验动物中心提供) 30只,体重180～220g,随机分为正常对照组(NC组)、DM对照组（DM组）、DM电刺激治疗组(DM治疗组) 3 组，每组10只。后两组腹腔注射链脲佐菌素(streptozotocin,STZ)柠檬酸缓冲液(65mg·kg－1) 诱导DM大鼠模型，第3天测血糖水平＞12mmol·L－1为DM大鼠模型建立成功［3］；NC组只注射柠檬酸缓冲液。报道［4］，DM大鼠模型制作成功后9～12周即可形成DM大鼠的膀胱病变，故本研究中DM大鼠造模成功10周后的大鼠即视为DCP模型鼠。

    1.2  实验材料

    STZ、乙酰胆碱(acetylcholine,Ach)、乌拉坦(urethan)均购自Sigma公司;电刺激仪器购自深圳市力合医疗器械有限公司;MedLab 生物信号采集处理系统购自南京美易科技公司;恒流泵购自上海沪西仪器分析厂;Krebs 缓冲液组成：NaCl 118mmol·L－1、KCl 4.7mmol·L－1、CaCl2 2.5mmol·L－1、MgSO4·7H2O 1.2mmol·L－1、NaHCO3 25mmol·L－1、KH2 PO4 1.2mmol·L－1、葡萄糖11mmol·L－1，pH 7.4;混合气体由95%的O2 和5%的CO2组成。

    1.3  分组治疗方法

    造模成功第10周起，予DM治疗组体外电刺激治疗：1个电极置于耻骨上膀胱区上缘，而另1个则置于骶尾关节上方0.5cm处；另1对电极分别置于大鼠腹中线两侧膀胱两侧壁处。刺激每天1次，每个疗程5 d，共3周。刺激参数：强度31V，密度31Hz。另两组大鼠只予置放电极，但不予电刺激。3周后测量相关数据。

    1.4  膀胱压力-容量测试

    25%的乌拉坦水溶液（1.0g·kg－1）腹腔注射麻醉，耻骨联合上缘切开皮肤，暴露出膀胱，置于切口处（可以避免腹腔压力对逼尿肌压的影响）。采用24G导管插入膀胱，连接三通管并固定，一端连接微量灌注泵，作膀胱灌注用（速度控制在0.4ml·min－1），另一端通过压力换能器连接MedLab 生物信号采集处理系统进行膀胱压测定。测定指标包括膀胱阈容量、残余尿量、残余尿量比(R%)、膀胱最大排尿压等。

    1.5  体外逼尿肌肌条收缩试验

    上述检查结束后即刻取出膀胱整体，称膀胱湿重，放入盛有37℃ Krebs 缓冲液的平皿中，纵行切成10mm×2mm肌条（两根）备用。离体逼尿肌条实验：取1根肌条,两端以丝线结扎,下端固定于盛有37℃ Krebs 液的器官槽底部,肌条全部浸入Krebs 液中,上端经张力传感器的小钩连至可调节肌条长度的微调螺旋上。张力传感器与MedLab 生物信号采集处理系统相连,检测信号输入机。Krebs 液中通以混合气体。静止张力为0.9g，此时肌条出现自发性收缩。

    电场刺激(electric field stimulation,EFS) 实验参数：波宽0.1ms,电压80V,频率为1、2、4、8、16、32Hz,每隔3min刺激10s。Ach诱导逼尿肌条收缩实验：以不同浓度(10- 7～10- 3mmol·L－1)Ach诱发肌条收缩作对照,每一浓度刺激结束后均用Krebs 液冲洗平衡肌条3次，共9min。

    1.6  统计学处理

    数据以x- ±s 表示,统计方法采用单因素方差分析,组间均数比较采用SNK-q检验,P＜0.05表示组间差异具有统计学意义。

    2  结    果

    2.1  一般情况

    造模前及造模后第10周（治疗前）、第13周（治疗后）大鼠的一般状况见表1。

　　2.2  膀胱容量和压力测定

    各组大鼠尿动力学曲线如图1所示，各组尿动力学实验参数比较见表2。DM组膀胱容量和R%显著 表1  各组大鼠不同时间体重、膀胱湿重及血糖的比较大于NC组（P＜0.01），与DM组相比差异也具有统计学意义(P＜0.05)。DM组膀胱压力显著小于NC组(P＜0.01),与DM治疗组相比差异也有统计学意义(P＜0.01)。

    1 mmHg=0.133 kPa

    图1  各组大鼠尿动力学的典型曲线  DM大鼠膀胱排尿时压力显著低于另两组，并可见不稳定收缩,电刺激治疗后可改善表2  各组大鼠尿动力学实验参数比较 注：1mmHg=0.133kPa

    2.3  膀胱逼尿肌肌条收缩力变化

    各组逼尿肌肌条按每100mg逼尿肌组织产生的张力作图，用Ach和EFS分别作用于肌条后,3 组逼尿肌肌条收缩强度均有显著升高。Ach刺激其浓度- 张力曲线如图2，DM组的张力显著低于NC组（P＜0.01），DM治疗组的张力有所改善，与DM组差异有统计学意义。EFS实验的频率- 张力曲线如图3，DM组产生的张力显著低于NC组（P＜0.01），DM治疗组的刺激效果获得改善，DM治疗组与DM组的差异具有统计学意义。

    3  讨    论

    医学研究已证明,外周神经病变是DM多种慢性并发症的共同病因，可以累及运动、感觉、自主神经，而通常以感觉神经最先受累，各种因素（包括代谢、血管、神经营养）均可破坏神经细胞的结构，造成神经传导速度下降。在这些病人中超过50%的患者患有DM膀胱病变,其致病机制主要包括肌源性损害和神经源性损害两大方面。DM膀胱功能的损害主要表现在储尿和排尿功能障碍两个方面：储尿功能障碍体现在患者充盈感觉功能减弱，膀胱阈容量增大；而排尿功能障碍则表现为排尿困难、剩余尿增多、排尿不尽、充溢性尿失禁、肾功能不全等相应症状，甚至频繁发作尿路感染等。

    到目前为止，由于DM膀胱功能损害的具体机制尚不清楚，因此临床治疗缺乏针对性，疗效不佳，治疗手段有限，以药物治疗为主，主要包括控制血糖(用胰岛素等)、营养神经(VitB12、弥可保)、促进膀胱收缩（溴吡斯的明、西沙比利）、改善微循环(川芎嗪、丹参、黄芪)及使用抗生素等，但往往只能暂时缓解症状，病情容易反复发作，且疗效不佳，不少患者甚至到需行膀胱造瘘等外科手段干预尿潴留的形成。一个多世纪以来，电刺激手段应用于膀胱功能障碍得到了极大的发展，目前骶神经调节技术更是获得FDA的批准可以用于顽固性排尿功能障碍的临床治疗，通过尿管行膀胱内电刺激已被证实可以帮助改善小儿的排尿困难［5］，临床研究已经证实使用胃部电刺激可以改善DM的胃轻瘫症状［6］，因而我们拟利用无创的体表电刺激技术来改善DM膀胱大鼠的排尿功能障碍，并初步探讨其可能的机制。

    我们的实验结果显示：DM大鼠造模成功10周后膀胱阈容量、残余尿及膀胱湿重明显增加，体重明显减轻，逼尿肌肌条收缩力明显下降，而电刺激治疗组治疗3周后膀胱阈容量、残余尿减少，逼尿肌肌条收缩力得到改善，差异均有统计学意义。这些数据提示电刺激治疗可以改善DM所引起的膀胱功能障碍。分析电刺激的作用可能有以下几点：（1）改善膀胱本体充盈感觉。由于感觉神经受到损害而引起DM膀胱的残余尿量、膀胱阈容量增加，是DCP患者起病的重要因素之一，降钙素基因相关肽(CGRP)是膀胱感觉神经的重要递质之一。电刺激治疗可能通过调节该蛋白的合成发挥作用（提高膀胱的感觉功能，进而可以促进排尿反射的加强，改善排尿功能）［7］，在下一步实验中我们将进行这方面的研究。（2）电刺激技术直接增强传出神经的传导速度，进而提升逼尿肌收缩力。在各组的逼尿肌肌条试验中，电刺激治疗组的肌条收缩力强于DM组（P＜0.05）。（3）曾有研究显示DM大鼠的膀胱逼肌尿肌条在Ach刺激下强度大于正常组［8］，但本组实验结果与其相反，考虑可能与大鼠对DM耐受程度、DM病程长短及血糖高低不同有关。本组大鼠平均于造模成功后10周开始进行相关实验，病程较长，故而并发症出现的较为典型［4］，因为DM膀胱病的病变是一种时间依赖性的改变，故Ach受体代偿性增加的情况已不存在，并且其活性和数量进一步减少，因此电刺激组大鼠的逼尿肌肌条在Ach刺激后张力大于DM组，考虑可能与其提高了胆碱能受体的活性有关。（4）体外电刺激可以促进神经损伤/再生长相关基因（GAP-43，BDNF）的表达［9］，发挥对已损伤神经的再生和再分布作用，帮助完成神经的改善过程，进而可以改善DM外周神经病变引起的相应症状(有待我们进一步进行相关实验)。

    总之我们初步认为,体外电刺激具有改善DCP的作用，其机制主要是恢复膀胱本体感觉功能，促进已损伤神经的修复和再生，增加神经传导速度，提高胆碱能受体的活性，从而有效地增强逼尿肌收缩力。

【】
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