磁性纳米四氧化三铁及纳米金协同柔红霉素作用于K562/A02细胞的初步研究
作者：戴永援，陈宝安，王雪梅，张仁云，高峰，丁家华，高冲，孙耘玉，程坚，赵刚，王骏
【摘要】 目的:研究磁性纳米四氧化三铁（Nano?Fe3O4）及纳米金（Nano?Au）是否具有逆转K562/A02细胞耐药的作用。方法：用MTT法测定盐酸柔红霉素（DNR）对K562/A02和K562细胞的毒性，并观察DNR与Nano?Fe3O4或Nano?Au的联合作用。结果：体积分数为25%的Nano?Fe3O4及Nano?Au能有效增强DNR的细胞毒作用，提高细胞的凋亡率，差异具有显著性。结论：Nano?Fe3O4及Nano?Au结合DNR后均能有效逆转K562/A02细胞的耐药性。
【关键词】 磁性纳米四氧化三铁；纳米金；柔红霉素；多药耐药；K562/A02细胞
盐酸柔红霉素（daunomycin，DNR）属蒽环类抗肿瘤药，是一种目前广泛应用于血液系统肿瘤和各种实体瘤的化疗药。DNR等细胞毒性药物在杀伤肿瘤细胞的同时也产生了严重的药物副作用，加大药物剂量能相应提升局部药物浓度而提高药物疗效，但也将增加全身的毒副作用。另外，在化疗过程中很多肿瘤细胞能对化疗药物产生耐受而降低疗效，多药耐药(multidrug resistance，MDR)已成为肿瘤患者化疗最终失败的主要原因。寻求各种能有效提高局部药物浓度的途径是肿瘤领域研究的热点之一。传统的MDR逆转剂有钙拮抗剂、环孢菌素类、激素及抗激素类化合物、蛋白激酶抑制剂、氨基哌啶衍生物S9788等[1]。逆转剂的应用虽然是解决MDR的一种常用方法,但因其毒性较强、副作用较大而影响它在临床的广泛应用，因此，借助某些药物载体系统，减少药物用量，实现药物的靶向给药将是颇有意义的新途径。近年来纳米载体逆转肿瘤细胞MDR已受到越来越多的关注，磁性纳米四氧化三铁（Nano?Fe3O4）是一种磁性强、制备相对简单而且生物相容性较好的磁性材料，是生物医学领域常采用的磁性载体材料[2]。本实验研究了Nano?Fe3O4及纳米金（Nano?Au）对K562/A02细胞MDR的逆转效果。
1 材料和方法
1.1 细胞系和培养条件K562/A02细胞是经阿霉素逐步诱导、具有MDR表型的稳定细胞系，由医学院血液学研究所杨纯正教授、齐静老师提供。K562/A02细胞维持增殖的阿霉素终浓度为1mg·L-1，实验前无药培养2周。K562敏感细胞系由作者所在实验室保存。接种于含10%小牛血清的RPMI 1640培养液，置于37℃、5%CO2饱和湿度培养箱中，2～3 d传代1次。
1.2 实验仪器、药物及试剂LDZ5?2离心机（北京医用离心机厂），Sartorius BS110S天平（北京赛多利斯天平有限公司），HZ?8201K 恒温振荡器（太仓市科教器材厂），DNR（Farmitalia公司），RPMI 1640培养基、小牛血清（Gibco公司），噻唑蓝（MTT，Sigma公司），Model 550酶标仪（日本BIO?RAD公司），FACSCALIBUR流式细胞仪（美国BD公司），Nano?Fe3O4及Nano?Au由东南大学生物科学与医学工程学院提供，在使用前将纳米粉粒用灭菌水溶解，超声混匀，制备成饱和溶液。
1.3 方法
1.3.1 MTT法 取处于对数生长期的K562/A02和K562细胞，调整浓度为12×104 ml-1，分别加入浓度为50、2?5mg·L-1的DNR，倍比稀释6个浓度，测定DNR对此两种细胞的生长抑制曲线，同样测定Nano?Fe3O4及Nano?Au对此两种细胞的生长抑制曲线，对DNR和两种纳米材料进行多种浓度的组合，选取抑制效果最明显的组合作为药物干预浓度。每个浓度设3个复孔，另设细胞对照组。以每孔200μl接种到96孔培养板，置37℃、5%CO2的培养箱中培养48 h，每孔加入5g·L-1 MTT 20μl，继续培养4 h，弃去各孔内的液体，每孔加入DMSO 150μl，振荡10 min后在酶标仪540 nm处测定吸光度(A)值，并按下列公式不同浓度细胞生长抑制率。 生长抑制率（%）=(1-实验孔A值/对照孔A值)×100%。
1.3.2 流式细胞术检测细胞凋亡及细胞内DNR浓度 根据蒽环类药物自发荧光的特性(DNR在488 nm的激发光下发红光)检测细胞内DNR浓度。取对数生长期的K562/A02细胞，按处理条件分为：A组，空白对照组；B组，DNR组；C组，DNR加Nano?Fe3O4组；D组，DNR加Nano?Au组。48 h后收获细胞，冷PBS洗涤2次，1 ml PBS重悬后上样。1.4 统计学处理MTT和流式细胞术测定数据的统计处理采用统计软件SPSS 11.5，显著性检验采用单因素方差分析，P<0.05为差异有显著性。
2 结果
2.1 MTT实验结果DNR对K562/A02和K562细胞的生长抑制曲线见图1、2。计算出DNR对K562/A02和K562细胞的IC50(48 h)分别是23.23mg·L-1和0.307mg·L-1。Nano?Fe3O4或Nano?Au单用时对K562/A02或K562细胞的生长抑制率与对照组相比差异无显著性（P>0.05）。分别选取较小IC50的10、20mg·L-1 DNR和0?05、0.1mg·L-1 DNR联合不同体积分数的纳米材料观察对细胞的毒性作用，发现纳米材料联合DNR对两种细胞的生长抑制率与对照组相比差异有显著性(P<0.001)，K562/A02细胞以25%体积分数的纳米材料联合DNR 10mg·L-1逆转效果明显，K562细胞以12.5%的纳米材料效果显著，见表1、2。
图1 DNR对K562/A02细胞增殖的影响（略）
Fig 1 The effect of DNR on the K562/A02 cell growth
图2 DNR对K562细胞增殖的影响（略）
Fig 2 The effect of DNR on the K562 cell growth
表1 单用DNR或联合纳米材料对K562/A02细胞毒性作用（略）
Tab 1 Cytotoxicity of DNR with or without nanoparticle on K562/A02 cells
与无纳米材料组相比，1）P<0.01，2）P<0.05
表2 单用DNR或联合纳米材料对K562细胞毒性作用（略）
Tab 2 Cytotoxicity of DNR with or without nanoparticle on K562 cells （略）
与无纳米材料组相比，1）P<0.05，2）P<0.01
2.2 流式细胞术检测各组K562/A02细胞凋亡情况根据MTT结果选取终浓度为10mg·L-1的DNR和25%的纳米材料干预细胞，流式细胞术检测结果显示，A、B、C、D组细胞48 h的凋亡率依次为0.92%、12.57%、32.76%及29.38%，如图3。
2.3 流式细胞术检测K562/A02细胞内的DNR浓度 根据DNR的激发自发荧光检测不同干预方案下的细胞内DNR浓度：10mg·L-1 DNR作用于K562/A02细胞48 h，细胞内DNR平均荧光强度为34.69；10mg·L-1 DNR 联合25%Nano?Fe3O4或Nano?Au分别作用于 K562/A02细胞48 h，细胞内DNR平均荧光分别为59.34和52.37,DNR浓度分别提高了71%和51%。
A.A组; B.B组; C.C组; D.D组
图3 各药物干预组K562/A02细胞凋亡率（略）
Fig 3 Rate of apoptosis induced by DNR with or without nanoparticle on K562/A02 cells
3 讨论
肿瘤是威胁人类健康的主要疾病，化疗目前还是肿瘤的主要手段之一，而MDR在化疗过程中又不可避免，是肿瘤治疗失败的重要原因，表现为肿瘤细胞对多种结构相异、功能不同的抗癌药物产生交叉耐药现象。MDR发生机制复杂，涉及许多方面，主要包括属于ATP超家族的P糖蛋白(P?gp)和MDR相关蛋白1(MRP1)。P?gp及MRP1具有细胞膜离子“泵”样作用，可以将细胞内的药物“泵”到细胞外，使细胞内药物浓度降低从而产生耐药[3-4]。有学者强调细胞内的有效药量累计是一个药物吸收和药物外排的动态过程，如果有足够大的药物吸收量，耐药蛋白引起的药物外排也只是个无效循环[5]。总之，任何能提高化疗药物有效浓度的方法都是目前克服肿瘤耐药的可行方法。随着对肿瘤多药耐药性的实质和产生机理的深入研究，关于逆转耐药的探讨也越来越受重视。MDR逆转剂非常迅速，已经历了以环孢菌素A、维拉帕米、他莫昔芬等为代表的第1代逆转剂，以维拉帕米R型同分异构体dexverapamil和PSC?833等为代表的第2代逆转剂，以GF120918、LY335979、XR9051、OC144?093等为代表的第3代逆转剂。而且PSC?833是迄今为止化疗增敏作用最强的耐药逆转剂，已经进入了Ⅲ期临床试验。纳米技术通过有效改善化疗药物给药途径，拮抗和抵消肿瘤细胞主动外排药物的作用从而提高肿瘤细胞内的药物浓度，初步显示了良好和可行的应用前景。利用纳米载体包裹化疗药物是逆转肿瘤细胞MDR的一项探索性研究[6]。已有不少成功报道通过制作不同的药物纳米粒以提高药物对肿瘤细胞的杀伤作用[6?8]，其机制还不是很明确。本实验发现Nano?Fe3O4及Nano?Au能协同DNR有效地抑制K562/A02细胞生长，流式细胞术检测纳米材料联合DNR干预K562/A02细胞后能有效提高耐药细胞内DNR浓度，并促进耐药细胞的凋亡，与无纳米材料组相比有显著性差异，提示可以利用纳米材料协同DNR来减少DNR的化疗剂量，减轻其对人体造成的严重毒副作用。实验同时证明等量的Nano?Fe3O4及Nano?Au对K562/A02细胞无明显毒副作用。另外Nano?Fe3O4及Nano?Au具有磁性的纳米粒子，对它外加磁场可以更好地控制其靶向性[9]，使药物局部浓度增高，既减轻药物对全身的副作用，又可以有效地杀死肿瘤细胞从而达到治疗的目的。
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