葛根素对体外培养人腹膜间皮细胞保护作用的研究

【摘要】  目的:了解葛根素对体外培养的人腹膜间皮细胞增殖活性、氧化应激和转移生长因子?β1（TGF?β1）分泌的影响。方法:体外培养人腹膜间皮细胞，分对照组，腹膜透析液（PDS）组及葛根素1、2、3组（葛根素终浓度依次为50、100、200μg·ml-1）5组观察。检测各组间皮细胞的增殖活性，上清MDA、SOD、GSH水平以及TGF?β1的含量并进行比较。结果:在PDS干预下腹膜间皮细胞MTT还原能力明显下降，上清液MDA水平较对照组显著升高，SOD、GSH水平较对照组显著降低。葛根素组MDA水平显著低于PDS组，SOD、GSH水平显著高于PDS组。腹膜间皮细胞在PDS干预下分泌TGF?β1较对照组显著增加，葛根素组TGF?β1分泌与PDS组比较有显著下降。结论:葛根素可以拮抗商业性PDS对腹膜间皮细胞增殖活性的抑制作用，可以抑制氧化应激和TGF?β1分泌。

【关键词】  葛根素；人腹膜间皮细胞；转移生长因子?β1；腹膜透析液；氧化应激

　腹膜透析是终末期肾病患者首选的肾脏替代方式之一[1]。然而随着透析时间的延长，腹膜纤维化形成成为导致患者腹膜功能丧失和透析退出的主要原因。研究表明，腹膜透析液（peritoneal dialysis solution,PDS）的生物不相容性导致的腹膜间皮细胞损伤是腹膜纤维化发生的起始因素。有效保护腹膜间皮细胞能够阻止或延缓腹膜纤维化的进展，给腹膜透析患者带来益处。我们通过观察葛根素对腹膜间皮细胞增殖活性、氧化应激以及转移生长因子?β1（TGF?β1）分泌的影响，明确葛根素是否具有拮抗PDS对腹膜间皮细胞的损伤，从而保护腹膜间皮细胞，发挥潜在的抗腹膜纤维化作用。

　　1  材料与方法

　　1.1  材料2.5%Baxter PDS为广州百特医疗用品公司产品，pH5.2,内含葡萄糖0.139mol·L-1、乳酸4.97mol·L-1；葛根素注射剂为浙江康恩贝制药股份有限公司产品，规格250mg·支-1；磷酸盐缓冲液（PBS）、胎牛血清（FBS）、RPMI 1640粉剂以及胰蛋白酶等购自GIBCO公司；TGF?β1 ELISA检测试剂盒购自晶美生物有限公司；四甲基偶氮唑盐（MTT）、二甲亚砜（DMSO）为Sigma公司产品；GSH、SOD、MDA检测试剂盒购自南京建成生物工程研究所；微量蛋白BCA检测试剂盒购自碧云天生物有限公司；抗细胞角蛋白抗体、抗波形蛋白抗体、第八因子抗体和抗白细胞CD45抗体购自北京中山生物技术有限公司；完全培养基为含20%FBS、105  U·L-1青霉素和100μg·ml-1链霉素的RPMI 1640培养液。全自动酶标仪(Sunrise)为Biobank公司产品。

　　1.2  方法

　　1.2.1  人腹膜间皮细胞的分离、培养与鉴定  取非尿毒症和糖尿病择期手术病人（n=5）的网膜作为间皮细胞来源,按[2]方法培养人腹膜间皮细胞。当细胞生长融合成单层时用0.25%胰酶?0.01%EDTA消化,按1∶3传代,第3代用于实验。传代细胞经倒置显微镜观察和免疫组化抗细胞角蛋白抗体、抗波形蛋白抗体染色阳性,抗第八因子抗体和抗白细胞CD45抗体染色阴性鉴定。

　　1.2.2  细胞增殖活力检测（MTT法）  用含20%FBS的RPMI 1640培养液将第2代消化细胞重悬成1×105ml-1的细胞悬液。置96孔培养板培养,每孔200μl，当细胞融合度达到80％左右时,用含0.1%FBS的RPMI 1640培养液同步24h后分5组观察,每组设2个复孔。对照组为加入RPMI 1640与完全培养基各100μl，PDS组为加入PDS与完全培养基各100μl；葛根素1、2、3组分别为含葛根素100、200、400μg·ml-1的PDS与完全培养基各100μl，葛根素终浓度依次为50、100、200μg·ml-1；37℃、5%CO2培养箱培养48h后弃上清,以完全培养基100μl和浓度为5 mg·ml-1的MTT(以0.1 mol,pH 7.2的PBS配制)100μl加入培养孔中继续培养3h,弃上清液,每孔加入DMSO 200μl 震荡混匀,取100μl加入96孔板在492 nm处测吸光度(A)值,值为620 nm,以A值表示间皮细胞活性。

　　1.2.3  氧化应激指标检测  消化第2代融合细胞,用含20%FBS的RPMI 1640培养液重悬细胞 (细胞浓度为1×105ml-1),接种24孔培养板培养,每孔0.5ml，当细胞融合度达到80％左右时,用含0.1%FBS的RPMI 1640培养液同步24h后分5组观察，每份做3批次，设1个复孔。对照组加入RPMI 1640与完全培养基各0.5ml，葛根素1、2、3组分别为含葛根素的PDS 与完全培养基各0.5ml，葛根素终浓度同前。37℃、5%CO2培养箱培养48h，上清液于-20℃保存,按试剂盒说明用比色法检测上清MDA、SOD、GSH浓度。

　　1.2.4  TGF?β1检测  分组处理同1.2.2，上清液-20℃保存,按ELISA试剂盒说明检测TGF?β1水平。细胞部分用 0.1 mol·L-1氢氧化钠溶解,微量蛋白BCA检测试剂盒测定蛋白质浓度,用相应蛋白质浓度结果校正TGF?β1检测结果。

　　1.3  统计学处理结果用x-±s表示，组间差异比较采用SPSS软件进行方差分析，P<0.05表示存在显著性差异。

　　2  结果

　　2.1  间皮细胞增殖活性检测结果培养的腹膜间皮细胞经PDS干预后，其MTT还原能力显著低于对照组，A值为（0?177±0?010）vs （0?400±0?103）,P<0?01；葛根素1、2、3组间皮细胞MTT还原能力A值依次为（0?244±0?035）、（0?301±0?034）和（0?335±0?041），显著高于PDS组（均P<0?01）。葛根素1、2、3组间皮细胞MTT还原能力与对照组比较显著降低（P<0?05）。间皮细胞增殖活性葛根素2组显著高于葛根素1组（P<0?01），葛根素3组显著高于葛根素2组（P<0?05）。见图1(图中及其后表中葛根素1、2、3组依次简称为葛1组、葛2组、葛3组)。

　　**与PDS组比较，P<0.01

　　图1  葛根素对间皮细胞MTT还原能力的影响（略）

　　2.2  氧化应激指标检测结果培养的腹膜间皮细胞经PDS和葛根素干预后，上清液MDA、SOD、GSH水平见表1。其中PDS组MDA水平显著高于对照组（P<0.01），SOD、GSH水平均显著低于对照组（均P<0.01）。MDA水平葛根素1、2、3组均显著低于PDS组（均P<0.05），葛根素3组显著低于葛根素1、2组（均P<0.05）。SOD水平葛根素1、2、3组均显著高于PDS组（均P<0.05），葛根素2组显著高于葛根素1组（P<0.01）,葛根素3组显著高于葛根素1、2组（均P<0.05）。GSH水平葛根素1、2、3组均显著高于PDS组（均P<0.05），葛根素2组显著高于葛根素1组（P<0.05），葛根素3组显著高于葛根素1、2组（均P<0.01）。

　　表1  不同剂量葛根素对间皮细胞氧化应激的影响（略）

　　与PDS组相比，1）P<0.01，2）P<0.05

　　2.3  上清液TGF?β1检测结果培养的腹膜间皮细胞经PDS和葛根素干预后，上清液中TGF?β1含量变化见图2。上清液中TGF?β1含量PDS组为(21.23±5.79)ng·mg-1,较对照组 [为（8.03±2.56） ng·mg-1]显著升高（P<0.01）；葛根素1、2、3组依次为（15.22±3.86）、（12.92±3.52）和（9.70±1.71）ng·mg-1，显著低于PDS组（均P<0.01）；葛根素组之间比较，葛根素3组显著低于葛根素1、2组（均P<0.01）。

　　**与PDS组比较，P<0.01

　　图2  葛根素对间皮细胞TGF?β1分泌的影响（略）

　　3  讨论

　　腹膜透析作为有效的肾脏替代方法已经被越来越多的尿毒症患者所接受，随着腹膜透析时间的延长，腹膜发生纤维化导致腹膜功能衰竭是患者退出治疗的主要原因之一。PDS具有明显的生物不相容性，其导致腹膜间皮细胞损伤被认为是腹膜透析相关腹膜纤维化的关键因素[3]。而有效保护腹膜间皮细胞则可以明显延缓腹膜纤维化的进程。大量的研究表明，葛根素可以拮抗多种因素尤其是高糖相关因素对细胞造成的损伤[4?6]。葛根素能否拮抗PDS对腹膜间皮细胞的损伤目前并无报道。因此，本研究在体外培养条件下通过向培养液中添加不同浓度的葛根素，观察其对腹膜间皮细胞增殖活性、氧化应激以及TGF?β1分泌的影响，初步了解葛根素对腹膜间皮细胞的保护作用及其潜在拮抗腹膜纤维化的作用。商业性PDS可以抑制腹膜间皮细胞的增殖活性，影响间皮细胞损伤后再修复，促进腹膜纤维化的发生[7]。本研究结果显示，腹膜间皮细胞经PDS干预后，其间皮细胞增殖活性较对照组显著降低，证实商业性PDS可以抑制腹膜间皮细胞的增殖活性。在葛根素组腹膜间皮细胞增殖活性得到明显改善，并且改善的程度呈明显剂量依赖的特点，提示葛根素可以拮抗PDS对腹膜间皮细胞增殖活性的抑制作用，起到保护腹膜间皮细胞的作用。研究显示，含葡萄糖透析液可以通过氧化应激导致腹膜间皮细胞损伤[8]。氧化应激能显著激活信号传递系统，刺激细胞肥大、早衰、凋亡以及抑制细胞增生。Gotloib等[9]通过动物试验向腹腔注射脱氧胆酸，在明显增加透出液MDA水平的同时观察到腹膜间皮细胞明显减少，提示氧化应激参与了腹膜的损伤。相反，抑制氧化应激产生则可能起到保护腹膜的作用。Günal等[10]通过使用含曲美他嗪的透析液，发现在抑制氧化应激的同时能够显著减轻透析液对腹膜的损伤。大量的研究证实，葛根素具有明显的抗氧化应激作用。从本研究也可以看出，在培养液中加入葛根素可以明显抑制PDS诱导的间皮细胞氧化应激产生，而且这种作用呈现浓度依赖，提示葛根素可以通过抑制氧化应激对腹膜间皮细胞产生保护作用。TGF?β1是一种重要的致纤维化细胞因子，正常的腹膜间皮细胞有TGF?β1的表达和分泌。非生物相容性透析液可以导致腹膜间皮细胞TGF?β1过度分泌和表达，从而促进细胞外基质的合成与分泌并减少细胞外基质的降解，导致腹膜纤维化的发生[11?12]。从本研究的结果可以看出，在培养液中添加PDS后其上清液中TGF?β1的含量与对照组比较显著升高（P<0.01）,说明商业性PDS具有刺激腹膜间皮细胞TGF?β1分泌的作用，与以往的研究结果[13]一致。本研究中通过向培养液中添加葛根素后与PDS组比较，间皮细胞分泌TGF?β1明显减少（P<0.01），提示葛根素具有抑制PDS导致的腹膜间皮细胞TGF?β1过度分泌的作用。有研究显示，抑制氧化应激反应可以抑制腹膜间皮细胞TGF?β1的分泌[14]。葛根素抑制TGF?β1分泌的作用是否与其抑制氧化应激有关，尚待进一步研究。综上所述，葛根素可以明显拮抗商业性PDS对腹膜间皮细胞增殖活性的抑制作用，可以抑制氧化应激和TGF?β1分泌，具有潜在的保护腹膜间皮细胞和拮抗腹膜纤维化的作用。

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