青蒿琥酯逆转K562/A02细胞对阿霉素耐药性机理的研究

[摘要]目的：研究青蒿琥酯逆转K562/A02细胞对阿霉素的耐药性及其作用机制。方法：以对阿霉素敏感的K562细胞作为对照，用MTT法观察在有或无阿霉素存在条件下青蒿琥酯对培养的K562/A02细胞干预48 h后的生长抑制情况,流式细胞仪检测100 μg・ml-1青蒿琥酯作用48 h前后K562/A02细胞 P糖蛋白（Pgp）平均荧光强度（MFI）的强弱,生化方法检测100 μg・ml-1青蒿琥酯作用48 h前后K562/A02细胞内谷胱甘肽（GSH）的含量。 结果：(1)在不含阿霉素情况下，青蒿琥酯对K562及K562/A02细胞的IC50分别为13.80 μg・ml-1和13.62 μg・ml-1（P＞0.05），在阿霉素存在情况下，青蒿琥酯对K562/A02细胞抑制作用明显增加（P＜0.01）；(2)与K562细胞Pgp的表达相比,K562/A02细胞Pgp高表达,青蒿琥酯处理前后K562/A02细胞的MFI无差别（P＞0.05）；(3)青蒿琥酯处理后K562/A02细胞内GSH含量较处理前明显下降（P＜0.05）。结论：青蒿琥酯对K562及K562/A02细胞具有细胞毒作用，且可逆转K562/A02细胞对阿霉素的耐药，其机制可能是通过干扰细胞内GSHGSHｓ转移酶系统功能的发挥，而非对Pgp表达的影响。

    [关键词]青蒿琥酯；多药耐药；K562/A02细胞；谷胱甘肽

     多药耐药(multidrug resistance,MDR)是指肿瘤细胞对一种化疗药物出现耐药的同时,对其他结构不同、作用靶位不同的化疗药物亦产生抗药性，是肿瘤化疗失败和复发的根源。目前寻找低毒、高效的耐药逆转剂已经成为肿瘤研究的方向。K562/A02 细胞是经阿霉素逐步诱导、具有MDR表型的稳定细胞系。我们在研究青蒿琥酯抗肿瘤的过程中发现，K562/A02细胞同K562细胞一样均对青蒿琥酯敏感，并且青蒿琥酯的存在可逆转K562/A02细胞对阿霉素的耐药性，其不影响K562/A02细胞Pgp的表达而显著降低K562/A02细胞内谷胱甘肽（GSH）的含量，现报道如下。

    1  材料和方法

    1．1  细胞系及细胞培养人红白血病细胞株K562及K562/A02细胞由东南大学临床医学院中心实验室提供。K562细胞接种于含10%小牛血清的RPMI 1640 培养液,K562/A02细胞接种于含2 μg・ml-1阿霉素、10%小牛血清的RPMI 1640 培养液,置于37 ℃、5%CO2 培养箱中,2～3 d传代1 次。

    1.2  主要药物及试剂青蒿琥酯（广西桂林制药二厂，批号 010901），临用前溶于5％的NaHCO3溶液中，然后用RPMI 1640培养液稀释；四氮唑蓝（MTT，Gibco公司）；二甲基亚砜（DMSO，Sigma公司）；Pgp 单抗(PEUIC2美国Coulter 公司)；GSH测定试剂盒、考马斯亮蓝蛋白测定试剂盒(南京建成生物工程研究所)。

    1.3  青蒿琥酯对K562及K562/A02细胞增殖的影响取对数生长期K562及K562/A02细胞,调细胞浓度为1.0×105 ml-1 。青蒿琥酯分别用含10%小牛血清的RPMI 1640 培养液及含2 μg・ml-1阿霉素、10%小牛血清的RPMI 1640 培养液稀释,作用终浓度依次为100、50、25、12.5、6.25、3.125 μg・ml-1。将各浓度青蒿琥酯分别与0.1 ml培养细胞加入96 孔平底培养板中，每组样本设5个复孔。37 ℃、5%CO2 饱和湿度下培养48 h。在终止培养前4 h每孔加入MTT 20 μl(5 mg・ml－1),继续培养4 h后离心10 min,弃上清液,加入DMSO 150 μl，放在平板振荡器上振荡溶解甲10 min；将培养板置ELSA酶标仪在570 nm波长处测每孔的光密度（OD）值并记录。抑制率并利用何尔恩法［1］计算半数抑制浓度（IC50）。抑制率＝（1-实验组OD／对照组OD）×100％。

    1．4  青蒿琥酯对K562/A02细胞 Pgp 表达的影响无菌收集对数生长期的K562及K562/A02细胞,细胞浓度为2×106 ml-1。PBS 洗涤,PEUIC2 4 ℃避光反应30 min,PBS洗涤后重悬,流式细胞仪检测细胞Pgp平均荧光强度（MFI），设不加PEUIC2组作为自身阴性对照。K562/A02细胞经100 μg・ml-1青蒿琥酯处理48 h后无菌收集，配成浓度为2×106 ml-1的细胞悬液。按上述方法测Pgp的MFI。

    1．5  青蒿琥酯对K562/A02细胞内GSH含量的影响取对数生长期K562及K562/A02细胞,调细胞浓度为1.0×105 ml-1 ，分为K562 细胞无药组、K562/A02细胞无药组及K562/A02 细胞药物（100 μg・ml-1青蒿琥酯）处理组。培养48 h后收集细胞,PBS 洗涤后调整细胞数为1×106 ml-1,取2 ml破碎细胞,离心后留取上清。实验按试剂盒说明书操作,显色反应后测定吸光度,于595 nm波长处测定蛋白,412 nm波长处测定GSH含量。实验重复4次。计算各实验组蛋白含量及细胞内GSH 含量。

    1．6  统计学处理数据用x-±s表示，两组间采用t检验进行显著性分析。

    2  结    果

    2．1  青蒿琥酯对K562及K562/A02细胞增殖的影响青蒿琥酯对K562及K562/A02细胞抑制率见表１。在不含阿霉素情况下，青蒿琥酯对K562及K562/A02细胞的IC50分别为13.80 μg・ml-1和13.62 μg・ml-1（P＞0.05），但是在阿霉素存在情况下，青蒿琥酯对K562/A02细胞的IC50为2.64 μg・ml-1，差异非常显著（P＜0.01），说明青蒿琥酯可以逆转K562/A02细胞对阿霉素的耐药，两者具有协同性。表1  青蒿琥酯对K562及K562/A02细胞的抑制率

    2．2  青蒿琥酯对K562/A02细胞Pgp 表达的影响在K562细胞的自身阴性对照组,Pgp的MFI为0.186±0.135,而在加入PEUIC2的K562细胞,Pgp的MFI为0.179±0.128 ,两者之间差异无显著性(P＞0.05)，说明K562细胞膜上没有Pgp表达；加入PEUIC2的K562/A02细胞，Pgp的 MFI为23.006±3.431，与自身阴性对照组的0.387±0.229相比，差异有显著性(P＜0.05)，说明K562/A02细胞膜上有Pgp高水平表达，提示Pgp参与了K562/A02的耐药机制。K562/A02加入100 μg ・ml-1青蒿琥酯处理后的MFI为19.625±2.694，与药物处理前的23.006±3.431相比，差异无明显统计学意义(P＞0.05)，说明青蒿琥酯对Pgp表达无影响。

    2．3  青蒿琥酯对K562/A02细胞内GSH含量的影响细胞内GSH含量K562/A02细胞为（143.210±25.344）mg・（mg pro）-1,K562细胞为（69.740±16.124）mg・（mg pro）-1，两者相比，P＜0.05,差异具有显著性，说明K562/A02细胞耐药与GSH高表达有关。100 μg・ml-1青蒿琥酯处理48 h后，K562/A02细胞内GSH 含量为（65.040±10.674）mg・（mg pro）-1，较药物处理前明显降低(P＜0.05)。

    3  讨    论

　　K562/A02 细胞是用逐步增加培养基中阿霉素浓度建立的一株有稳定的典型MDR表型的人白血病细胞系，具有Pgp表达阳性、mdr1 mRNA高表达、GSHs转移酶(GST) 活性高、拓扑异构酶Ⅱ mRNA 低表达等生物学特性[2]。其中mdr1/Pgp表达异常增高可迅速将进入细胞内的药物主动地“泵”出细胞外,降低白血病细胞内的药物浓度,无法构成对白血病细胞的有效杀伤而导致MDR的发生；GST活性增高，增强了GSH与化疗药物或其氧化应激产物的结合，降低化疗药物细胞毒作用，同时促进药物外排，也降低细胞内药物浓度，因此细胞内GSH含量增高也是多药耐药的机制之一。青蒿素及其衍生物在全世界广泛应用于抗疟，对抢救和治疗脑型和恶性疟疾发挥着重要作用，尤其是对多药耐药的难治性疟疾以其快速而显著的疗效和独特机制而为世界所关注[3]。近年来，国内外许多学者[45]均报道青蒿素及其衍生物具有抗肿瘤的作用。本实验中的青蒿琥酯无论是对K562细胞还是K562/A02细胞均显示有良好的细胞毒作用，与阿霉素无交叉耐药性，并且青蒿琥酯的存在可逆转K562/A02细胞对阿霉素的耐药性。本研究中Pgp表达水平测定结果显示,K562细胞无Pgp表达,而K562/A02细胞显示Pgp高表达,提示K562/A02细胞耐药性与mdr1基因及其编码的Pgp过表达有关。但在本研究中,当加用100 μg・ml-1青蒿琥酯后,K562/A02 细胞的Pgp表达水平均无明显改变,提示青蒿琥酯逆转K562/A02细胞的耐药作用并不是通过直接下调Pgp表达水平而发挥作用。本研究结果显示，耐药的K562/A02 细胞内GSH含量高于敏感的K562细胞内GSH含量,提示细胞内GSH含量增高是K562/A02细胞形成MDR的机制之一。当加用100 μg・ml-1青蒿琥酯后,K562/A02细胞系的GSH含量明显降低，说明青蒿琥酯逆转K562/A02耐药可能与此有关。研究表明[6]，青蒿素类药物抗疟机制为其利用疟原虫细胞内存在的铁离子，催化裂解其分子结构中的过氧桥产生含碳自由基，该自由基烷基化细胞内蛋白，使其丧失功能，从而达到杀灭疟原虫的目的。据此推测青蒿琥酯逆转耐药的可能机制为其干扰了细胞内GSHGST系统功能的发挥，导致细胞内阿霉素浓度增加，恢复阿霉素的细胞毒作用。关于此点有待进一步研究证明。

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    [3]YANG C Z ,LUAN F J,XIONG D S ,et al.Multidrug resistance in leukemic cell line K562/ A02 induced by doxorubicin[J]. 药理学报,1995,16(4)：333337.

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