三生饮对局灶性脑缺血大鼠海马区Bcl2和Bax蛋白表达的影响
作者：王长松,王媛媛,晋光荣
[摘要]目的：探讨三生饮对大鼠局灶性脑缺血后海马区细胞凋亡相关基因Bcl2和Bax蛋白表达的影响。方法：用线栓法建立大鼠局灶性脑缺血再灌注模型，用SP免疫组织化学方法，检测再灌注后3、6、12、24 h及3 d不同时段海马区Bcl2和Bax免疫反应阳性细胞平均计数，统计分析三生饮组和模型组的表达量。结果：两组海马区神经元均大量表达Bax蛋白，两组间无统计学差异；与模型组相比，三生饮治疗组大鼠缺血侧海马区Bcl2蛋白表达增多，表达时程延长（P<0.05）；在缺血侧海马不同区域，Bcl2/Bax之值不同。结论：大鼠脑缺血再灌注后海马区神经元均有Bcl2和Bax蛋白的表达，而灌给三生饮可促进海马区Bcl2阳性细胞的表达，提高Bcl2/Bax值；但三生饮治疗组大鼠海马区脑细胞仍然过度表达Bax阳性蛋白，最终发生凋亡。
[关键词]三生饮；脑缺血；海马；Bcl2蛋白；Bax蛋白；大鼠
三生饮是治疗卒中的代表方剂。以往的研究表明，该方可以缩小脑缺血大鼠的梗死体积，在局灶性脑缺血再灌注损伤中，可增加缺血侧大脑皮质Bcl2的表达，延长表达时程，提高Bcl2/Bax之值，减少脑缺血后的细胞凋亡[1]。本实验拟进一步观察该方对大鼠局灶性脑缺血再灌注损伤后海马区Bcl2和Bax蛋白表达的影响，以期为揭示三生饮的作用机理提供实验依据。
1 材料与方法
1．1 动物健康成年SD（Sprague Dawley）大鼠99只，雌雄不拘，体重200~250 g。
1．2 试剂兔抗Bcl2、Bax单克隆抗体（美国Santa crus公司），通用浓缩型SP（过氧化酶标记的链霉亲合素简称SP）试剂盒（山羊血清封闭液，生物素标记羊抗兔IgG，辣根酶标记链霉卵白素）、DAB显色液。以上抗体与试剂均从北京中山生物技术有限公司购得。1．3 药物三生饮生药包括生南星30 g、生川乌15 g、生附子15 g、木香7.5 g、生姜18 g，均由东南大学附属中大中药房提供，常规水煎，浓缩至实验所需浓度。
1．4 模型制作参照Zea Longa线栓法制作大鼠局灶性脑缺血再灌注模型[2]。大鼠称重后，用0.4%戊巴比妥钠腹腔麻醉，固定于手术台上；分离右侧颈总动脉及同侧迷走神经，避免误扎；分离颈内及颈外动脉，结扎颈外动脉及颈总动脉近心端，用微动脉夹夹闭颈内动脉，于颈总动脉远心端剪一小口插入尼龙线；松开微动脉夹，沿颈总动脉轻推线入颈内动脉至有阻力时止，系紧结扎线，缝合切口，线尾端露于体外；从颈总动脉分叉处算起进线约（18.5±0.5）mm，记录结扎时间，1.5 h后拔出尼龙线10 mm行再灌注；假手术组插入深度小于9 mm。
1．5 分组及给药造模后参照Longa 5分制评分标准评定，剔除0分及4分大鼠。将造模成功的大鼠随机分为模型组和三生饮治疗组（简称治疗组）各30只；分别在缺血再灌注后3、6、12、24 h及3 d 5个时间点处死大鼠，每个时间点6只。另设正常对照组（简称正常组）3只，假手术组6只。给药：术前1 d开始灌胃给药，每12 h 1次。其中，治疗组灌给浓度为1 g・ml-1的三生饮煎剂，每次2 ml，其它各组灌给蒸馏水每次2 ml。
1．6 取材与切片用0.4%戊巴比妥钠过量麻醉大鼠，开胸腔经心灌注固定后取脑，后固定2 h，置30%蔗糖磷酸缓冲液中4 ℃过夜沉底；自视交叉后2 mm处，切取厚为2 mm的脑组织块，置Leica冰冻切片机切片，片厚7~8 μm，隔5张取1张贴片，-20 ℃冰箱保存。
1．7 Bcl2、Bax免疫组化检测取出冰冻切片，室温融化，磷酸盐缓冲溶液(PBS）冲洗5 min×3次，分别滴加0.3%双氧水(H2O2）10 min、羊血清封闭液（1∶10）15 min，一抗（1∶100），4 ℃冰箱过夜。生物素标记羊抗兔IgG（1∶300），37 ℃恒温箱30 min，辣根酶标记链霉卵白素（1∶300），37 ℃恒温箱30 min。以上各步骤均以0.01 mol・L-1PBS（pH 7.2~7.4）冲洗3 min×3次，DAB显色，镜下控制反应时间，终止反应；苏木素轻度复染，脱水，透明，中性树胶封片，镜下观察。对照试验用PBS代替一抗，余同上，结果阴性。
1．8 统计学处理每张切片随机采集6个具有代表性的高倍视野，采用网格计数法计数阳性细胞。结果用SPSS统计软件包进行统计分析，两样本比较采用方差分析和t检验，P<0.05表示有显著性差异。
2 结 果
2．1 海马区神经元在脑缺血再灌注后不同时间Bcl2的表达正常组与假手术组均未见Bcl2阳性细胞表达，而治疗组和模型组海马区Bcl2阳性细胞在再灌注后3、6 h均有表达，表达量无显著性差异；随时间延长两组均有不同程度增加，至再灌注后12 h模型组Bcl2阳性细胞达峰值，而治疗组于再灌注后24 h表达数最多，之后呈减少趋势；再灌注后3 d，治疗组Bcl2阳性细胞表达量较多，与模型组比较有统计学差异（P<0.05）。见表1。2．2 海马区神经元在脑缺血再灌注后不同时间Bax的表达正常组和假手术组海马区均未见Bax阳性细胞表达，而治疗组和模型组在再灌注3、6、12 h，海马区Bax阳性细胞表达随时间增加而增多，至24 h呈峰值，两组表达数量无显著性差异；再灌注24 h后Bax阳性细胞减少，两组比较也无显著性差异。见表1。表1 脑缺血再灌注后不同时间海马区Bcl2、Bax的表达
3 讨 论
脑缺血属中医“中风”范畴，急性期以风痰血瘀为主要病理因素，而“毒损脑络”是其重要的病理机制[3]，辨证选用中药可取得良好效果。然而，长期以来，由于畏惧药物的毒性，许多疗效独特的中药方剂被束之高阁。实际上，有毒中草药有其毒性的一面，也有其作用的一面。只要正确使用，往往能产生显著的治疗效果。对于有毒中药，不仅可以通过合理配伍减毒增效，而且可以通过控制剂量、改变用药途径、选择用药对象等，达到特定的治疗效果。中药天南星、川乌、附子均是有毒之品，生用毒性更大。但三生饮的配方却别出心裁，竟以三味大毒之品不经炮制直接入方，用于治疗中风急症寒痰壅滞之证。古人对本方多有应用和论述，清・姚济苍的《卒中厥证辑要》甚至将其列为治疗卒中的主方。然而，由于本方的竣烈毒性，当代医家对其效果少有探索。浏览近10年全国中文期刊，有关该方的研究寥寥无几，但研究结果值得重视。孙爱续等通过动物实验证明，三生饮能显著增加脑血流量和股动脉血流量，降低脑氧耗量，且全方作用效果明显优于拆方；同时该方的疗效与其毒性密切相关[45]；杨万章等证明该方对大鼠脑出血具有确切效果[67]。因此，有必要用药和动物试验方法研究三生饮的毒性和效用，这是开发脑缺血急性期高活性新药的重要途径，也是发挥中医优势的新思路。海马是大脑边缘系统的重要组成部分，其血管构筑非常独特，是脑内对缺血最敏感的区域。局灶性脑缺血再灌注损伤可导致海马区神经元的凋亡，而Bcl2基因及Bax参与凋亡的调节：由Bcl2基因编码的Bcl2蛋白可促进细胞的存活，而Bax蛋白则加速细胞的死亡；当Bcl2过量表达时，其与Bax形成的异源二聚体可以抑制细胞的凋亡；而当细胞中Bax过量表达时，凋亡效应则增强[8]。本实验提示，三生饮有促进海马区Bcl2阳性细胞表达的作用，但这一作用还不足以抑制细胞的凋亡，因而海马区脑细胞仍然过度表达Bax阳性蛋白，最终发生凋亡。作者在实验中还发现，在缺血不同区域，Bcl2/Bax之值完全不同：CA1区Bcl2表达量极少，Bcl2/Bax值较小，细胞趋于死亡；而CA3区Bcl2表达量增加，Bcl2/Bax值也随之增大，有可能减缓细胞的凋亡。现代药理学研究证明，三生饮中的5味药所含成分有相当一部分可起协同作用，起到抗氧化、扩张血管、降低血压、抑制血小板聚集等作用。作者以往的研究发现，该方可在脑缺血再灌注12 h促进大脑皮质的Bcl2的表达，增加Bcl2/Bax值，抑制Bax蛋白表达引起的凋亡[1]。实验中还发现一些星形胶质细胞也有Bcl2及Bax蛋白的表达，其意义有待于进一步的研究。当然，三生饮作为复方制剂，其治疗脑缺血损伤的具体机制尚不能用一两种基因的表达来解释。为明确其机理，还需在组织或系统的水平进一步研究。
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