猪急性心肌梗死模型的建立

             作者：蒋益波，冯毅，丁建东，王宇

　 [摘要]目的：探讨应用经皮腔内冠状动脉成形术(PTCA)球囊堵闭猪冠状动脉建立急性心肌梗死动物模型的实验方法。方法：选用苏中幼猪12只,麻醉后经股动脉置入PTCA球囊至冠状动脉左回旋支分支,堵闭血流90 min，行心电图、血流动力学、心脏二维超声、TTC染色及光镜、电镜检查以判断急性心肌梗死模型是否成功建立。结果：12 只猪均完成冠状动脉左回旋支分支的封堵,部分实验动物显示心电图呈典型急性心肌梗死动态图形变化,球囊堵塞1 h 后超声检查出现心室局部运动异常; 堵塞90 min再灌注30 min后处死猪，取出心肌作TTC染色及光镜、电镜检测，证明成功建立猪急性心肌梗死模型。结论：应用PTCA球囊封堵冠状动脉可成功建立猪急性心肌梗死模型,方法简便易行，具有创伤小、死亡率低等优点。

    [关键词]心肌梗死；猪；动物模型

    目前,国外多采用猪做心血管疾病研究的模型。猪的心脏在解剖结构、心脏血管分布、心脏与体重比等方面和人的心脏很相似,特别是其冠状动脉系统侧支交叉分布较少以及不易建立新的侧支循环[1]的特性是大鼠、兔及犬的心脏所不可比拟的。作者在参照的基础上,摸索出一套简便易行的方法,成功地建立了猪心肌梗死（心梗）模型。

　　1  资料与方法

    1.1  动物健康小型猪，由东南大学医学院动物中心提供，均为雄性，体重25~30 kg，共12只。

    1.2  TTC染色剂氯化三苯基四氮唑（2，3，5Triphenyltetrazoliumchloride，TTC，Sigma公司） 2 g加入生理盐水200 ml配制成1%的TTC。

    1．3  方法

    1．3．1  实验动物的麻醉  基础麻醉：术前禁食8 h，安定1 mg・kg-1、氯胺酮10 mg・kg-1、阿托品1 mg肌肉注射。维持麻醉：戊巴比妥钠0.1 mg・kg-1・min-1耳静脉维持。气管插管：插管型号7.0，长度28 cm，插入长度26 cm。呼吸机：容量控制在12 ml・kg-1，12 次・min-1。给氧浓度60%。

    1．3.2  心梗模型的建立  动物取仰卧位，右侧腹股沟部、前胸部及四肢备皮，常规消毒后铺巾，切开皮肤、皮下组织及肌肉，分离暴露出右股动脉。动脉穿刺后经J型0.035 in（1 in=0.025 4 m ）导丝送入6 F（1F=0.33mm）动脉鞘管，肝素100 U・kg－1，隔1 h静脉注射肝素1 000 U。用0.035 in导丝引导将6  FJudkins造影导管送至主动脉根部，注射欧乃派克行左、右冠状动脉造影，明确分析冠状动脉分布，选择左回旋支分支为堵塞目标血管，选用指引导管6 F JL（Judkins Left）置入左冠状动脉，将0.014 in经皮腔内冠状动脉成形术（percutaneous fransluminal coronary angioplasty,PTCA)导丝放至左回旋支分支，造影确认后用压力泵以3~6 atm（1 atm=101．325 kPa）扩张球囊，行缺血预适应三四次，每次球囊充盈20 s，间隔3~5 min，无明显异常反应后扩张球囊90 min。造影证实血流阻塞，90 min后将球囊撤出，再灌注30 min。在心梗模型建立过程中，接心电监护仪，监测心电图、血流动力学的动态变化，并监测超声心动图的变化。

    1．3.3  心脏标本的染色及光镜检查  （1）TTC染色：静脉注射10% KCl 20 ml将猪处死，迅速开胸取出心脏，用生理盐水将残余血液冲洗干净，垂直于心脏长轴，自心尖向心底将心脏切成4 mm厚的短轴面切片，然后置于1% TTC磷酸盐缓冲液中，放入37 ℃恒温水浴箱20 min之后在10% 福尔马林中固定。正常心肌染色呈砖红色，坏死心肌呈灰白色。数码相机拍照。（2）HE染色：快速、准确切取心梗区和缺血区、正常区组织（不超过1 cm大小），置入10%福尔马林固定液中，固定后行组织修整、洗涤、酒精逐级脱水，二甲苯置换出组织块中的酒精，石蜡包埋，切片机切成4 μm的薄片，HE染色，封片，光镜观察。

    1.3.4  标本的电镜检查  快速、准确切取心梗区和正常心肌组织约1 mm3大小，立即置于4%戊二醛固定液中固定2 h，磷酸盐缓冲液漂洗3次，酒精逐级脱水，环氧丙烷浸透20 min，由包埋剂包埋样品并聚合（60 ℃），半簿（500 nm）切片定位，超簿（50 nm）切片，醋酸铀和枸橼酸铅双重染色，电镜观察。

    1．4统计学处理应用SPSS 10.0软件进行统计学处理，计量资料均以x-±s表示，采用t检验进行显著性检验，P<0.05为差异有统计学意义。

    2  结    果

    2．1   急性心梗模型的制作结果12只猪均完成冠状动脉左回旋支分支的封堵，成功建立急性心梗模型，试验过程中未出现室速、室颤等心律异常，部分实验动物心电图显示呈急性心梗典型图形变化。梗死前后血流动力学无明显变化。见图1、2及表1。        A．正常时冠状动脉造影图像表1  实验过程中血流动力学的变化注：1 mmHg=0.133 kPa

    2.2  肌细胞学检查结果分别用光镜和电镜检测正常心肌、存活心肌和坏死心肌，均呈相应的结构改变，与TTC染色结果对比，证明了TTC染色结果的准确性，见图3、4。

    3  讨    论

　　以往动物实验主要通过开胸结扎不同部位冠状动脉建立心梗模型[12]。此法沿用多年，动物创伤大、死亡率高、术后难饲养、恢复较慢，且实验的学习过程较长。随着冠心病介入的开展和普及、冠状动脉造影及PTCA等技术的日臻成熟，废弃导管、导丝和球囊等仍可用于动物实验，降低实验成本[3]。而猪的心脏结构及测量方法都和人相似。我们用超声心动图进行检测,可获得满意的图像,因此，猪可作为模拟人的理想动物[4]。本次实验前人研究成果[5]选择放置球囊于左回旋支。球囊堵塞左回旋支分支后,超声心动图检查显示猪心功能下降,且病理检查证实心梗存在,表明本法成功建立了猪心梗模型。通过实验，我们的体会是制作猪的心梗动物模型主要应掌握以下几个关键之处：（1）动物的麻醉程度。以动物的心电图、心率较平稳，动物口腔肌群已经松弛，用力拉开时没有阻力为较好。如果麻醉过深，有可能引起动物死亡。（2）气管插管是否成功。这一步较为关键，气管插管时要注意猪的喉头处较脆弱，受到刺激时易水肿，可能造成阻塞。插管的口径要细，最好不用带有气囊的插管。（3）堵塞部位及范围的选择。既往研究显示，当心梗面积超过40%时，将导致严重心功能损害[6]；而损伤面积小于20%时，不会对血流动力学产生明显影响[7]。本次实验堵塞范围较小，故梗死前后血流动力学无明显变化。（4）实施球囊持续性堵闭之前进行适当缺血预适应[8]。 另外，本次实验过程持续时间较短，故实验过程中未见有室速、室颤等恶性心律失常发生。 TTC染色时，正常心肌呈砖红色，存活心肌呈淡红色，梗死心肌染色阴性而呈苍白色。TTC染色是动物实验中确定存活心肌与梗死心肌的可靠方法。因为TTC在脱氢酶完整的组织(正常和存活心肌)内形成红色沉淀，因此正常心肌染成砖红色，存活心肌呈淡红色，梗死心肌由于缺乏完整的脱氢酶系统而不染色，这样就可以将梗死心肌与正常及危险心肌区别开来。光镜及电镜检查显示：TTC染色呈砖红色为正常心肌细胞，界限清楚，心肌横纹清晰可见，肌纤维排列整齐，心肌细胞形态正常，核形态正常。存活心肌区呈淡红色，可见微血管和肌原纤维、心肌细胞等仅轻度损伤。而染色为苍白色的心肌显示心肌细胞界限不清，胞浆肿胀、溶解、坏死，心肌纤维断裂，心肌横纹模糊，细胞核溶解，从而验证TTC染色结果准确可靠。

    [参考]

    [1]李永秋，徐明，姚绍鑫，等．实验性家兔颈动脉球囊扩张动脉狭窄动物模型的建立[J]．动脉硬化杂志，2003，11(3)：263266．

    [2]WEAVER M E．A quantitative study of the anatomy and distribution of coronary arteries in comparison with other animals and man[J].Cardiovascular Research，1986,20:907．

    [3]STADIUS M L,MAYNRSD C,FRITZ J K,et al.Coronary anatomy and left ventricular function in the first 12 hours of acute myocardial infarction[J].Circulation，1985,72:292. 

    [4]HUGHES G C,POST M J,SIMONS M，et al. Translational physiology：porcine models of human coronary artery disease：implications for preclinical trials of therapeutic angigenesis[J].Appl Physiol，2003,94:16891701.

    [5]OHTSUKA S,SUZUKI S,ISHIKAWA K,et al. Norepinephrine release is increased in the hibernating heart,studied in a chronic canine model of myocardial hibernation[J].J Cardiovasc Pharmacol,2000,36(Suppl 2):S35S41.

    [6]PAGE D L,CAULFIELD J B,KASTOR J A,et al. Myocardial changes associated with cardiogenic shock[J]. N Engl J Med,1971,285:133137.

    [7]KLEIN M D,HERMAN M V,GORLIN R. A hemodynamic study of left ventricular aneurysm[J]. Circulation,1967,35:614630.

    [8]卢新政,王连生,黄峻,等.冠状动脉堵闭法建立猪心肌梗死模型[J].中国动脉硬化杂志,2004,12 (2)：218220.