非小细胞肺癌中PTB对肿瘤抑制基因ceacam1选择性拼接的调控研究
[关键词]迷你基因；选择性拼接；癌胚抗原相关的细胞粘附分子1；拼接因子PTB；凝胶阻滞分析；非小细胞肺癌
癌胚抗原相关的细胞粘附分子1(CEACAM1或CCAM1)，在多种上皮细胞起源的肿瘤中起肿瘤抑制基因作用，属于免疫超家族基因[1]。该基因长约1.48 kb，共有9个外显子组成，其中第七外显子长53 bp，位于CEACAM1的胞内端，可通过选择性拼接去除，从而产生CEACAM1L和CEACAM1S两种转录产物。CEACAM1L 含外显子7，因此胞内端较长，而在CEACAM1S的形成中，由于外显子7被剪切，其胞内端少了73个氨基酸[2]。有研究表明，CEACAM1在多种肿瘤如肠癌、肝癌、乳腺癌和前列腺癌中的表达水平普遍下降[34]。当鼠的CEACAM1L被转入鼠的肠癌或乳腺等细胞时，细胞的生长速度明显减慢，恶性程度降低[57]。Estrera等[8]研究认为，仅表达CEACAM1L的胞内部分即能产生抑制肿瘤生长的作用，因此CEACAM1L的胞内端对抑制肿瘤的生长是必需的。在肺癌中，RNA原位杂交和Northern blot分析结果表明，CEACAM1L在75%的肺癌旁组织高表达，而CEACAM1S在84%的肺癌组织中高表达[9]。根据此现象，我们推测CEACAM1第7外显子的选择性拼接与某种拼接因子有关，CEACAM1两种拼接产物的表达谱受到该因子的调控。为了验证此假设，我们采用了迷你基因模型及凝胶迁移等实验表明了ceacam1的第7外显子序列能与拼接因子PTB(polypyrimidine tract binding protein，hnRNPⅠ)特异结合，CEACAM1L和CEACAM1S的表达比例与拼接因子PTB的表达水平相关。
1 材料和方法
1.1 菌株、质粒及试剂大肠杆菌DH5α由作者所在实验室保存。限制性内切酶、T4DNA连接酶购自TaKaRa公司，CompleteTM protease inhibitor cocktail购自Roche公司，BCA蛋白定量试剂盒购自Pierce公司，LipofectAMINETM和RNAzol试剂购自Invitrogen公司,Nonidet P40(NP40)购自Sigma公司。
1．2 方法
1.2.1 细胞培养 人非小细胞肺癌H157、H1944细胞株由美国M.D.安得森癌症中心毛力先生惠赠。细胞在37 ℃、5%CO2、DMEM/F12培养基（含5%的小牛血清、100 U・ml-1 青霉素和100 μg・ml-1 链霉素）中生长。
1.2.2 ceacam1迷你基因及ptbpCDNA重组质粒的构建 从H157细胞株提取RNA，以随机引物为模板逆转录成cDNA，用RTPCR方法获得ceacam1基因中从内含子5至外显子8长1 606 bp DNA片段，经酶切后插入到真核表达载体pCMV中，重组质粒经测序鉴定。引物序列为：5′GGGGTACCATGACAAATAATGCTCTACC3′和5′AAAAGCTTGTTAGGTGGGTCATTGG3′。为了避免内含子5和外显子6的连接处拼接位点对拼接可能的影响，我们将内含子5拼接位点内的“ag”突变为“aa”。PTB1、 PTB2和PTB43种pCDNAPTB 表达载体由冷泉港实验室David Helfman惠赠。
1.2.3 ceacam1迷你基因与ptbpCDNA共转染 选用H1944细胞株作为ceacam1 迷你基因及ptbpCDNA共转染的宿主细胞，实验按LipofectAMINETM 转染试剂盒操作说明书进行。细胞在100 mm 培养皿中长至约 80%，加入DNA/lipofectAMINETM混合物[10 μg・（40 μl）-1，室温放置40 min]和4 ml 无血清、无抗生素的培养基混合物，37 ℃培养6 h后，更换为含有血清和抗生素的培养基。转染72 h后收集细胞，用RNAzol提取总RNA，每种载体重复转染3次。用PCR法检测转染后细胞内的ceacam1 的表达产物。上游引物是位于外显子6中的序列S1：5′GGTTGCTCTGATAGCAGTAG3′；下游引物为载体上的T7序列S2：5′TAATACGACTCACTATAGGGAG3′。PCR反应条件如下：94 ℃变性1 min，55 ℃退火1 min，72 ℃延伸2 min，25个循环。PCR产物经测序鉴定。
1.2.4 核蛋白抽提物制备[10] 细胞培养至80%~90%密度，去除培养液，用预冷的PBS洗两次后收集细胞，重悬于500 μl缓冲液A中(含10 mmol・L-1KCl、1.5 mmol・L-1MgCl2、10 mmol・L-1DTT,0.1%NP40、 10 mmol・L-1Hepes、1 mmol・L-1PMSF及1×CompleteTM protease inhibitor cocktail ，pH 7.9，4 ℃)，冰上保温30 min 后离心10 min收集沉淀。重复上述步骤2次，沉淀重悬于100 μl缓冲液B(0.42 mol・L-1 NaCl,0.2 mmol・L-1EDTA，25%glycerol，20 mmol・L-1 Hepes，5 mmol・L-1DTT及10 mmol・L-1 PMSF，pH 7.9，4 ℃)，离心收集上清，对0.1×PBS（含1 mmol・L-1 DTT 和1 mmol・L-1PMSF）透析。蛋白浓度用BCA 蛋白试剂盒测定。
1.2.5 PTB的表达与 ceacam1两种表达产物的相关性分析 抗PTB的单克隆抗体由冷泉港实验室David Helfman惠赠，按1∶50稀释，免疫组化实验步骤按[11]进行。非小细胞肺癌的肿瘤组织及癌旁组织由M.D.Anderson癌症中心病系提供。按文献[12]提取临床标本的核蛋白，1×上样缓冲液（SDS loading buffer）溶解，煮沸5 min处理后行SDSPAGE。100 V、1.5 h将蛋白转至PVDF膜上，在含有20%Tween100的TBS（TBST）溶解的脱脂奶粉中封闭1 h，抗PTB的单克隆抗体为一抗（1∶200）室温孵育1 h，TBST清洗8次，每次5 ml，带有HRP标记的羊抗兔的二抗室温孵育1 h，TBST清洗8次，每次5 ml，加入发光底物，X线片感光显色观察。
1.2.6 凝胶迁移阻滞实验 根据ceacam1外显子7的核酸序列设计两个探针：ACE，5′CCAACCACA3′；GAE，5′CACAGACACAAACCC3′。用1.5 μCi γ 32PATP标记探针，用G25柱去除没有标记的γ 32PATP。32P标记的探针约3 ng与透析的H157细胞核抽提物(5 μg)在20 μl RNA结合缓冲液中（含20% glycerol、5mmol・L-1MgCl2、 2.5mmol・L-1EDTA、2.5mmol・L-1DTT、 250mmol・L-1NaCl及50 mmol・L-1TrisHCl,pH 7.5）,冰上孵育30 min，孵育物行7%非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳，压X线片，用标记的GAE互补链与细胞核抽提物的孵育物作阴性对照。
2 结 果
2.1 重组载体的构建PCR得到约为1.6 kb的ceacam1基因片段，经酶切连入真核表达载体pCMV，构建的重组载体经测序鉴定，与GenBank中的基因序列一致，阅读框不变（数据未显示）。
2.2 ceacam1迷你基因与PTB共转染ceacam1迷你基因与ptbpCMV共转染的PCR检测结果见图1。PTB1、PTB2及PTB4都影响ceacam1的两种表达产物的比例，使ceacam1L表达下降，其中PTB4的影响最大。仅转染ceacam1迷你基因的细胞中，ceacam1L占两条带的比例为76.7%，而与3种ptbpCMV共转染后，所占比例分别下降至58.3%、64.8%和54.0%。
2.3 PTB的表达与ceacam1两种表达产物的相关性分析用PCR法检测这些组织中ceacam1两种产物的表达水平，实验结果见图2；用Western blot法检测5对非小细胞肺癌肿瘤组织及癌旁组织中PTB的表达水平结果见图3。从图2、3可看出，在肿瘤组织中，ceacam1S的表达水平明显高于癌旁组织，而在这些肿瘤组织中PTB的表达水平也较高，两者有明显的相关性。
2.4 凝胶迁移阻滞实验在人、鼠的ceacam1外显子7中有23 nt 序列较保守，我们进一步发现，在富含A/C 的拼接增强子中常出现的3个CACA元件,同样出现在ceacam1的外显子7中，两个CACA elements 存在于该保守的23 nt 序列中(图4)。根据上述保守序列设计了两个探针GAE和ACE，在H157细胞株中检测了核抽提物和探针的结合能力。结果表明，含有2个CACA的（16nt）探针GAE的结合能力明显强于含1个CACA（8nt）的ACE探针(图5)，结合产物经质谱分析即为PTB蛋白。1. GAE与细胞核抽提物的孵育物；2．探针；3．标
3 讨 论
真核生物基因由外显子与内含子组成，通过转录形成的mRNA前体必须去除内含子，将外显子拼接起来，才能形成成熟的mRNA，作为翻译的模板。拼接有组成型拼接与选择型拼接两种，是基因表达的必经阶段，也是转录后遗传信息扩展的重要机制。有研究表明，人类因基因突变所致的疾病中，有15%是由拼接异常引起的。尽管拼接的缺失与肿瘤的因果关系还不十分清楚，但很多实验结果表明，人肿瘤中有很多基因拼接产物的比例发生了变化。PTB是hnRNP家族的一员，识别富含嘧啶的的核苷酸序列，能与U2AF竞争结合位点，在一些外显子选择剪切过程中起负调控作用。报道受PTB调控的基因有fgfr1、GABAA receptor γ2、 csrc、 fibronectin和α或βtropomyosin[1315]。免疫组化结果表明，在小细胞肺癌组织中PTB过表达与ceacam1L低表达呈明显相关性。有研究表明，在人glioblastoma细胞株中成纤维细胞生长因子受体1的62 bp的内含子序列对于其α外显子的去除是必需的[16]。我们推测在内含子6中应存在类似序列，因此构建了内含子6的一系列截短重组载体，并没有发现有类似功能的序列。比较人、鼠CEACAM1外显子7的序列时发现，外显子7中的23 nt 序列较保守，我们进一步发现在富含A/C 的拼接增强子中常出现的3个CACA元件,同样出现在CEACAM1的外显子7中，其中2个CACA elements 存在于该保守的23 nt 序列中(图4)。根据这些发现，我们设计了GAE和ACE两个探针，在H157细胞株中检测了核抽提物和探针的结合能力。实验结果表明，含有两个CACA的16nt探针的结合能力明显强于含1个CACA的8nt ACE，结合蛋白经质谱分析，即为PTB蛋白。至此我们首次证明了PTB在 ceacam1外显子7的选择性拼接中起拼接因子的作用，并发现了ceacam1中能与PTB特异结合的序列，为进一步研究PTB对ceacam1 外显子7选择性拼接的调控机制及其在肿瘤发生过程的作用奠定了基础。
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