肝细胞生长因子对子宫内膜癌细胞增殖影响的实验研究
作者：都红蕾，孙奋勇，陈勍，潘秋辉
【摘要】 目的 观察肝细胞生长因子（HGF）对子宫内膜癌细胞HEC?2B增殖的影响及子宫内膜癌细胞HEC?2B中HGF受体C?met的表达，了解HGF对子宫内膜癌细胞的作用及其机制。方法 体外培养人子宫内膜癌细胞HEC?2B，用RT?PCR的方法检测HEC?2B中HGF受体C?met有表达。对HEC?2B进行24 h血清饥饿后用不同剂量的HGF作用于HEC?2B。用四甲基偶氮唑盐微量酶反应比色法(MTT法)分析细胞的增殖力,用流式细胞仪检测细胞的增殖周期。结果 C?met在HEC?2B细胞中稳定表达，HGF促进细胞的增殖,并在一定的范围内有剂量依赖关系，各处理组与对照组相比，P<0.05。当HGF浓度达到60 ng· mL-1时，增殖水平较对照上调约1.9倍。结论 HGF/C?met能够在体外促进子宫内膜癌细胞的增殖。
【关键词】 子宫内膜癌细胞；肝细胞生长因子；肝细胞生长因子受体
Abstract:Objective To study the effects of hepatocyte growth factor on endometrial cancer cells, detect the alterations of cell proliferation and expression level of HGF receptor C?met and understand the molecular mechanism. Methods Endometrial cancer cell line, HEC?2B was cultured in vitro. The expression level of C?met in HEC?2B was determined with RT?PCR. HEC?2B was treated with HGF at different doses. Cell proliferation was analyzed with MTT assay. Cell cycle distribution was examined with FACS. Statistical evaluations were conducted using t?test. Results C?met was expressed in HEC?2B cells. Compared with controls, HGF could promoted the proliferation of HEC?2B in a dose?dependent manner (P<0.05). Treatment with 60 ng· mL-1 HGF increased the proliferation level by 1.9 fold. Conclusion C?met was expressed stably in HEC?2B cells. HGF/C?met system promoted the formation, development and proliferation of endometrial cancer cells in vitro.
Key words:endometrial cancer cell; hepatocyte growth factor; hepatocyte growth factor receptor
子宫内膜癌是女性生殖道常见三大恶性肿瘤之一，近20年来在世界范围内子宫内膜癌发病率有上升趋势。肝细胞生长因子(HGF)是一个多功能生长因子。HGF的单一受体C?met是一跨膜蛋白，由原癌基因C?met编码。在许多恶性肿瘤中C?met被过表达［1-6］。HGF/C?met与子宫内膜癌的关系却鲜有报道。本研究通过观察子宫内膜癌细胞中C?met的表达及HGF对子宫内膜癌细胞的作用，旨在为临床以HGF／C?met为靶点子宫内膜癌提供理论基础。
1 材料与方法
1.1 试剂与细胞株
子宫内膜癌细胞株HEC?2,购自中科院细胞库;RNase、胰蛋白酶、DMEM 培养基、Trizol、逆转录酶Superscript Ⅲ为Invitrogen公司产品;优质胎牛血清,Gibco公司;HGF购自R&D， Agarose 、G418 由Sigma公司提供。PCR用酶SYBR Green PCR Master Mix购自ABI公司。EPICS AL TRA流式细胞仪,美国Beckman Coulter公司提供。
1.2 HEC?2B细胞的体外培养与诱导
将细胞以1×105/cm2接种于细胞培养瓶中，每瓶加入5 mL含10%(φ)FBS（胎牛血清）的DMEM；培养24 h后，换5%FBS的DMEM饥饿培养12 h，分别加入浓度为20、40、60、80、100ng·mL-1的HGF进行处理，设置空白组不进行诱导，培养基中FBS的浓度改成5%；培养48 h后收集细胞。
1.3 PCR
用PBS清洗细胞，用Trizol法抽提RNA，并常规检测RNA的纯度及完整性。反转录，用人的β?actin基因检测反转录是否成功。PCR条件为：94 ℃ 5 min 激活聚合酶，94 ℃变性30 s，58 ℃退火30 s，72 ℃45 s，共33循环，72 ℃保温10 min，4 ℃保温10 min。采用琼脂糖凝胶检测的方法进一步验证。Realtime定量PCR条件为：95 ℃ 5 min 激活聚合酶，95 ℃变性15 s，57 ℃退火5 s，72 ℃ 25 s，共45循环。采用ABI7300系统进行检测，每个循环结束检测荧光强度。融解曲线分析:每分钟读1次，检测范围为55 ℃ 到 95 ℃。荧光强度检测采用动态跟踪的方法，自动测出Ct值（每个反应管内的荧光信号到达所设定的域值时所经历的循环数），用2?△△Ct 表示实验组目的基因的表达相对于对照组的变化倍数，并采用琼脂糖凝胶检测的方法进一步验证。Β?actin引物序列如下：上游引物 5′?gctct tttcc agcct tcctt?3′,下游引物 5′? tgatc cacat ctgct ggaag?3′。C?met检测引物序列：上游引物5′?ttcaagtagc caaagcgatg?3′,下游引物 5′?gtgtttacgtcaggataag?3′ 。C?met检测引物序列：上游引物5′?ttcaagtagc caaagcgatg?3′,下游引物 5′?gtgtttacgtcaggataag?3′,产物大小300 bp。
1.4 用MTT法检测细胞增殖能力
取对数生长期的细胞，用含0.25%(φ)胰酶消化，悬浮于适量培养基中，通过细胞计数将其浓度调整到4×104个细胞/mL。将此细胞悬液以100 μL/孔均匀接种到细胞培养板上，置于37 ℃，5％CO2的培养箱中，培养24 h后，换成稀释液，继续培养24 h，使细胞饥饿。分组加药，分别将含20、40、60、80、100 ng· mL-1HGF的培养液100 μL加入细胞培养孔中，每个稀释度做4个复孔，设立空白对照组。加样后置于37 ℃，5％CO2的培养箱中继续培养44 h，每孔加入20 μL MTT染色液，继续培养4 h；弃去培养液，加入抽提液150 μL/孔，置于微量振荡器张充分振匀以抽取染料，振动15 min。以570 nm为检测波长，630 nm为波长，用酶标仪测定各孔的吸光值（A）
1.5 流式细胞检测
消化并收集细胞，每检测管中(0.5～1)×106细胞，PBS清洗一遍，离心去上清，转速1 000 r/ min，5 min，沿管壁缓慢加入终浓度70％(φ)的乙醇，混匀，－20 ℃ 固定过夜，1 000 r/min 离心5 min去上清，PBS清洗一遍，加入Rnase抑制剂50 μL，加入50 μg/mL的PI染料混匀，4 ℃ 避光30 min，上机检测。
1.6 统计学方法
采用t检验，P<0.05 为差异有显著性。
2 结 果
2．1 HEC?2B的培养与传代
HEC?2B为起源于子宫内膜癌的细胞系，在10% 胎牛血清( Fetal Calf Serum, FCS)，DMEM培养基，5％ CO2，37℃的培养条件下，细胞生长良好，其形态见图1所示。
将上述总RNA逆转录后，采用PCR的方法进行扩增，电泳后进行EB染色（图3），发现得到条带的大小与预计的300 bp相符合，表明在HEC?2B细胞中具有C?met基因的转录。
经反复后传5、10、15、20、25代后，抽提总RNA，各样品之间RNA的量相近，C?met的转录水平基本维持不变。各组之间比较，P>0.05,差异无显著性。结果见图4、表1所示。
表1 RT?PCR测得C?met表达水平（略）
2．3 HGF对HEC?2B的影响
2．3.1 MTT法检测结果
20 ng· mL-1的HGF即能够明显促进HEC?2B的增殖，并表现为剂量依赖关系，当HGF浓度达到60 ng·mL-1时，增殖水平较对照上调约1.9倍，此后有所下降，100 ng·mL-1的HGF仍能够明显促进HEC?2B的增殖（图5）。
2．3.2 流式细胞检测结果
用20 ng·mL-1HGF处理HECT?2B细胞，即可使处于G1细胞比例减少，处于G2+S期细胞增多，当HGF浓度增加到60 ng·mL-1时，G1期细胞最少，G2+S期细胞最多。增殖指数（proliferation index, PI）可以用来反映细胞的增殖状况，各浓度的HGF处理组都可以明显促进HECT?2B细胞的增殖。结果见图6与表2所示。表2 HGF处理对HEC?2B细胞增殖周期的影响（略）
3 讨 论
肝细胞生长因子(HGF)首先从部分肝脏切除的大鼠的血清中提取，由于其对肝细胞具有强的丝裂原作用，因此命名为肝细胞生长因子［7］。HGF的单一受体C?met是一跨膜蛋白，由原癌基因C?met编码［5］。许多报道C?met在较多肿瘤中都有较高表达，这些肿瘤包括：卵巢癌［1］、肾癌［2］、膀胱癌［3］、乳腺癌［4］、胰腺癌［5］与前列腺癌［6］。但HGF/C?met在子宫内膜癌发生中所起作用却鲜有报导。
正常细胞的生长过程是一种有控生长，且会逐步分化；肿瘤细胞则生长失控化，幼稚化。肿瘤细胞体的不稳定性和非整倍体细胞的出现即是由这种细胞周期调节机制失控所造成的［7］。这种失控也使肿瘤细胞在传代时可能发生一些自发的重组而导致一些基因的启动子丢失，使这些基因不表达或表达量减少。本实验检测了HEC?2B细胞中C?met的表达情况，发现C?met的mRNA能够持续存在于HEC?2B细胞中。在体外持续的传代多达25次，仍能够检测到C?met的mRNA，而且数量没有明显的变化，充分说明在很长的时间范围内，C?met的启动子能够被持续稳定地激活，说明该基因表达对HEC?2B具有较为重要的生理或病意义。 本实验结果表明：MTT及流式细胞仪的结果均显示：20 ng·mL-1的HGF促进HEC?2B的增殖，当HGF浓度达到60 ng·mL-1时，促增殖作用最强，此后作用稍减弱，HGF浓度达到100 ng·mL-1时仍有一定促增殖作用，在一定范围内表现为剂量依赖关系。考虑与HGF是通过与受体结合来起作用有关：当HGF与受体结合未达到饱和时，促增殖作用随HGF浓度的增加而增强；当与受体结合达饱和时，增殖作用便不呈现剂量依赖性。内膜癌细胞中有C?met的表达，HGF能有效促进内膜癌细胞增殖。在体内，HGF是否与子宫内膜癌的发生、发展直接相关，问题的关键在于体内是否存在HGF直接作用于子宫内膜癌组织的可能性。
研究表明，在体内HGF可由子宫内膜上皮下层的基质细胞来分泌表达［8］ 。 HGF对子宫内膜上皮细胞的作用是以旁分泌的方式进行的。这样就给子宫内膜癌的发生发展提供了营养支持。Yoshida等［9］认为，肿瘤细胞能够分泌碱性成纤维细胞生长因子(basic fibroblast growth factor, bFGF)，而基质细胞膜上有bFGF的受体，一旦与配体结合后，即能够促进HGF的表达上调，反过来促进肿瘤细胞的生长。
本研究提示，HGF/C?met能够在体外促进子宫内膜癌的发生、发展与增殖。研究发现C?met是一个极有希望的靶点，一些HGF的拮抗剂已进入治疗肿瘤的实验阶段［10］。这一结果为通过阻断 HGF/C?met系统的表达或信号转导通路治疗内膜癌提供了新思路。
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