FcαR1基因 5′端调控及UTR区SNPs及其单倍型与华南地区汉族IgA肾病患者预后关系
作者：陈伟强，古宏标，李幼姬, 黄玮俊
【摘要】 目的 研究我国南方汉族IgA 肾病患者FcαR1基因5′端调控及UTR区SNPs及其单倍型与我国南方IgA肾病患者预后的关系。方法 采集266例肾活检证实的IgA肾病患者血样，提取基因组DNA。用PCR产物直接测序法鉴定基因型，每3～6个月查尿蛋白、血肌酐及其他指标随访，以血肌酐浓度比基础值升高1倍以上或死亡作为随访终点。采用单因素相关分析及Logistic多元回归分析各位点多态性及其单倍型与肾功能恶化及预后的关系。结果 （1）该区域单倍型对及-27、56位点多态性与肾功能进展显著相关;（2） -27位点基因型TC与TT比较差异显著（P=0.003）； 56位点基因型CC与TT比较，P=0.011；单倍型对TCC/CTC与TTT/TTT比较，P=0.000。结论 FcαR1基因第一外显子C56T多态位点基因型与我国南方IgAN患者预后相关。
【关键词】 IgA肾病; FcαR1基因；多态性; 预后；相关分析
Abstract:Objective To investigate the relationship between the prognoses and the polymorphisms of FcαR1 gene in Chinese Han IgA nephropathy (IgAN) patients in the South China.Methods 266 blood samples from renal?biopsies that had been proven IgA nephropathy were collected，the genotypes were determined by PCR product sequencing.All patients were followed up every 3 to 6 months by examining urinary protein, Scr, and other indicators.Follow?up was terminated when Scr value increased by one fold than the normal or in the case of the death of the patients.Follow?up lasted for more than six months.The relationship between the renal function and the polymorphisms of FcαR1 gene were evaluated by single factor analysis and multiple regression analysis with SPSS 10.0.Results (1)Haplotypes and -27, 56 loci were significantly correlated with the aggravation of renal function.(2)Genotype TC vs.TT in -27 locus, CC vs.TT in 56 locus, haplotypical TCC/CTC vs.TTT/TTT were different significantly on the aggravation of renal function in Chinese Han IgAN patients in the South China.Conclusion SNPs and it′s haplotypes of FcαR1 gene in 5′regulatory region and UTR region were associated with the prognoses of Chinese Han IgAN patients in the South China.
Key words:IgAN; FcαR1 gene; polymorphism; prognosis; correlation analysis
资料显示,约15 %～40 %IgA 肾病( immu?noglobulin A nephropathy, IgAN) 患者在确诊后的20年内逐渐进展到终末期肾衰(end stage renal failure,ESRF)。最近的一项研究表明，影响IgAN 预后的主要指标依次为：伴有高血压的男性患者；每天大于1 g的蛋白尿；肾功能损伤（肾小球滤过率小于60 mL/min）；严重的肾小球病理损伤（如严重系膜增殖、肾小球硬化、新月体形成和血管硬化等）［1］。近年来越来越多的研究表明, 遗传因素不但影响对该病的易感性, 且影响疾病的进程。已有研究发现包括ACE基因、ET?1及其受体基因多态位点与IgAN的进展相关［2-4］。
FcaR1系体内许多细胞表面特异性识别IgA的跨膜受体，与IgA结合后可触发吞噬及ADCC反应，产生过氧化物，释放炎症介质等，从而引发各种肾脏病理改变。有研究表明IgAN患者肾小球、中性粒细胞、单核细胞FcɑR1表达水平升高。也有研究发现当伴有血IgA水平升高时表达水平则降低。目前认为一种可溶解于血浆的FcɑR1与IgA形成的复合物可选择性地沉积在肾小球系膜区可能是FcɑR1致病的主要机理［5］。日本学者通过测序发现位于该基因5′调控区及第一外显子非转录区有3个SNPs，分别是T?114C、T?27C及T+56C，关于该多态性与IgAN发病的相关性研究日本学者的研究结果相互矛盾［6］。但体外研究证实这些多态性可影响该基因转录活性，而有关这些SNPs及其单倍型与IgAN预后的关系，国内外均未见报道。1 对象与方法
1.1 研究对象
266例患者系中大第一附属、香港大学玛丽医院1980～2004年肾活检确诊的IgA肾病患者，均符合WHO制定的IgA肾病诊断标准，并排除紫癜性肾炎、肝炎等继发病因。年龄2～61岁，平均年龄(29.9±9.9)岁，其中男121例，女145例。所有研究对象均获知情并自愿参加,且该项目得到中山大学医学伦理委员会批准。
1.2 方法
1.2.1 全血基因组DNA提取
按照QIAamp DNA Blood Maxi Kit试剂盒说明书操作。采用紫外分光光度法测定提取DNA的浓度与纯度。
1.2.2 PCR 扩增目的区域
根据FcαR1基因的核苷酸序(GenBank 序列号:X59875),设计扩增引物：上游引物5′?GCC CGT CTA TTT GGA TGT ?3′；下游引物5′?GGA GGG TGG TCT GTT TGG?3′。 反应体系为：10×PCR缓冲液(无镁) 2.5 μL、50 mmol/L MgCl2 1.5 μL、2 mmol/L dNTP混合物2.5 μL、10 μmol/L上、下游引物各1 μL、Taq DNA多聚酶(1 U/μL) 1.1 μL、DNA模板1 μL、灭菌去离子水加至25 μL；反应条件：94 ℃预变性3 min，94 ℃变性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸45 s，共30个循环，最后72 ℃延伸5 min。
1.2.3 FcαR1 5′端调控及UTR区SNPs多态性的鉴定、分型
PCR扩增含有FcαR1 5′端调控及UTR区单核苷酸多态性区域，反应体系为：10×PCR缓冲液(无镁) 2.5 μL、50 mmol/L MgCl2 1.5 μL、2 mmol/L dNTP混合物2.5 μL、10 μmol/L上、下游引物各1 μL、Taq DNA多聚酶(1 U/μL) 1.1 μL、DNA模板1 μL、灭菌去离子水加至25 μL；反应条件：94 ℃预变性3 min，94 ℃变性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸45 s，共30个循环，最后72 ℃延伸5 min。取PCR产物测序。
具体方法：纯化的DNA模板20 ng， ABI Prism BigDye Terminator Cycle Sequencing Ready Reaction Kit mix 2 μL，测序引物(同PCR扩增引物)10 pmol组成8 μL 反应体系进行测序PCR。反应条件：98 ℃1 min，96 ℃ 30 s，50 ℃ 30 s，60 ℃ 4 min，25个循环。3 mol/L乙酸钠(pH5.2)和无水乙醇沉淀扩增的DNA，再用75%(φ)乙醇洗涤1次，然后加入18 μL模板变性剂TSR(template suppression reagent)。测序模板在95 ℃水浴5 min，立即置于冰水中5 min将其淬灭成单链，转移至测序管，在ABI3100 全自动序列分析仪上进行毛细管电泳测序。
1.2.4 杂合子样本行双向测序确认
1.2.5 随访
对所有患者进行随访,每3～6个月检测尿蛋白、Scr等指标,以Scr值比基础值升高1倍以上或死亡为观察终点。随访时间> 6个月者才纳入成功随访病例。
1.2.6 统计学方法
用χ2 检验及Hardy?Weinberg平衡法评估标本的群体代表性。各组间基因型频率的差异用χ2检验；用Haploview软件构建及检验单倍型［7］；采用单因素相关分析及Logistic多元回归分析鉴定各位点多态性及其单倍型与肾功能恶化及预后的相关关系。全部数据均在SPSS 10.0统计学软件上进行。
2 结 果
2.1 经检验FcαR1 5′端调控及UTR区各SNPs的基因型频率符合遗传平衡定律(P>0.05)。
2.2 FcαR1 基因5′端调控及UTR区T-27C、T+56C及单倍型对多态性与IgAN肾功能进展的关系
分析单倍型对及-114、-27、56位点与肾功能进展的关系，结果表明单倍型对及－27、56位点与肾功能进展相关（P=0.002）。见表1、2。表1 FcαR1 基因5′端调控及UTR区SNPs单倍型对与IgAN肾功能进展的关系（略）表2 FcαR1 基因5′端调控及UTR区T?27C及T+56C多态性与IgAN肾功能进展的关系（略）
2.3 FcαR1 基因5′端调控及UTR区T-27C、T+56C及单倍型对多态性与IgAN肾功能进展多元回归分析
见表3～5，考虑到两组中可能有混杂因素不均衡，所以又采用Logistic回归分析，分析在控制年龄、性别、病程因素后，再比较各位点的影响。结果：与-27对应的P=0.011, 基因型TC相对于TT的差异有统计学意义（P=0.003）, OR(TC/TT)=3.558，OR的95％置信区间（1.546, 8.186）；与+56对应的P=0.014, 基因型CC相对于TT的差异有统计学意义（P=0.011）, OR(CC/TT)=3.424，OR的95％置信区间（1.329, 8.826）；与单倍型对对应的P=0.005, 基因型TCC/CTC相对于TTT/TTT的差异有统计学意义（P=0.000）, OR=10.267，OR的95％置信区间（3.054～34.514）。表3 FcαR1 基因5′端调控及UTR区SNPs单倍型对与IgAN肾功能进展的Logistic回归分析（略）注：其他单倍型对与TTT/TTT比较 表4 FcαR1 基因5′端调控区T?27C多态性与IgAN肾功能进展的Logistic回归分析（略）
表5 FcαR1 基因5′端UTR区T56C多态性与IgAN肾功能进展的Logistic回归分析（略）
3 讨 论
早期认为IgA肾病预后较好,事实上有不少患者呈进行性进展。IgAN发病初期常常无明显症状，因此临床上很难把握其病程，许多患者就诊时肾活检证实已有较为严重的肾小球损伤，可能是引起预后较差的重要原因。最近的一项研究表明，尽管多数患者早期就进行肾活检确诊，但5年及10年成活率分别只有85.1%及77.1% ，显示了本病进展至肾衰竭的速度并不慢［1］，因此识别IgA肾病进展危险因素对本病的具有重要意义。
越来越多证据表明,IgAN具有种族、地区遗传性和家族遗传性,遗传因素在IgAN的发生中起重要作用。其主要的证据来源于流行病学调查、家族性IgA肾病的发现、IgA肾病的家族聚集现象、动物模型的建立、相关基因或致病基因的发现等［8］。IgA肾病属于多因子疾病（或复杂病），即遗传因数和环境因数共同影响疾病的发生过程。基因组上数个基因的易感等位基因(allele)的组合构成复杂病的疾病易感性(susceptibility)或影响疾病的进展，当前复杂病病因学研究多以基因组上随机DNA或基因的多态标记进行疾病与标记间的非亲源关系群体关联分析。可仅对单个位点进行分析也可对多个位点组成的单体型进行相关分析，由于单体型中各位点间的顺式相互作用可增强影响力，因此检出效率更高。
研究结果表明－27位点TC基因型、＋56位点CC基因型以及TCC/CTC单倍型对与IgAN患者肾功能进展显著相关。考虑到两组中可能有混杂因素不均衡，所以又采用Logistic回归分析，分析在控制年龄、性别、病程因素后，再比较各位点的影响，结果：与-27对应的P=0.011, 基因型TC相对于TT的差异有统计学意义（P=0.003）, OR(TC/TT)=3.558，OR的95％置信区间（1.546～8.186）；与+56对应的P=0.014, 基因型CC相对于TT的差异有统计学意义（P=0.011）, OR (CC/TT) =3.424，OR的95％置信区间（1.329～8.826）；与单倍型对对应的P=0.005, 基因型TCC/CTC相对于TTT/TTT的差异有统计学意义（P=0.000）, OR=10.267，OR的95％置信区间（3.054～34.514）。
本研究的3个位点位于非转录区，其中－27位点可能是TATA盒的第一个碱基，因此这些多态性改变可能会影响FCαR1的表达水平。体外实验证实－114C和+56C单核细胞启动活性明显高于两位点等位基因均为T者［9］，结合本结果均提示CTC Haplotype 可能与IgAN患者FCαR1表达上调有关。有研究发现重度IgAN患者肾小球FCαR1表达上调时，肾组织病理损伤程度也更趋严重，聚集在肾内的吞噬细胞FCαR1表达上调，在IgA触发下，释放过氧化物与蛋白尿、血尿的严重程度相关［10，11］。这些基因型加速患者肾功能进展的确切机制还有待进一步研究。
【】
［1］LU J, ZHANG H, ZHOU Y, et al. Natural history of immunoglobulin A nephropathy and predictive factors of prognosis: a long?term follow up of 204 cases in China［J］.Nephrology, 2008,13(3):242-246.
［2］WOO K T, LAU Y K, ZHAO Y, et al.Disease progression,response to ACEI/ATRA therapy and influence of ACE gene in IgA nephritis ［J］.Cell Mol Immunol,2007,4(3):227-232.
［3］MAIXNEROV? D, MERTA M, REITEROV? J, et al.The influence of three endothelin?1 polymorphisms on the progression of IgA nephropathy［J］.Folia Biol (Praha),2007,53(1):27-32.
［4］REITEROV? J, MERTA M, STEKROV? J, et al.The influence of endothelin A receptor gene polymorphism on the progression of autosomal dominant polycystic kidney disease and IgA nephropathy［J］.Folia Biol (Praha),2007,53(4):134-137.
［5］MONTEIRO R C.Pathogenic role of IgA receptors in IgA nephropathy［J］.Contrib Nephrol,2007,157:64-69.
［6］NARITA I, GOTO S, SAITO N, et al.Genetic polymorphisms in the promoter and 5' UTR region of the Fc alpha receptor (CD89) are not associated with a risk of IgA nephropathy［J］.J Hum Genet, 2001,46(12):694-698.
［7］BARRETT J C, FRY B, MALLER J, et al.Haploview: analysis and visualization of LD and haplotype maps［J］.Bioinformatics,2005,21 (2):263-265.
［8］HSU S I.Racial and genetic factors in IgA nephropathy［J］.Semin Nephrol,2008,28(1):48-57.
［9］SHIMOKAWA T, TSUGE T, OKUMURA K, et al.Identification and characterization of the promoter for the gene encoding the human myeloid IgA Fc receptor (FcalphaR, CD89)［J］.Immunogenetics, 2000,51(11):945-954.
［10］KASHEM A, ENDOH M, YANO N,et al.Glomerular FcαR expression and disease activity in IgA nephropathy［J］.Am J Kidney Dis, 1997,30(3):389-396.
［11］KASHEM A, ENDOH M, NOMOTO Y,et al.Monocyte superoxide generation and its IgA?receptor in IgA nephropathy［J］.Clin Nephrol,1996,45(1): 1-9.
