助孕胶囊对多囊卵巢大鼠血清性激素及卵巢肿瘤坏死因子α表达的影响

                    作者：刘艳巧，党慧敏，刘润侠，康晓玲

【摘要】  目的 观察助孕胶囊对多囊卵巢（PCO）大鼠生殖内分泌激素、卵巢组织肿瘤坏死因子α表达的影响，探讨其对PCO模型大鼠可能的作用机制。方法 采用孕激素联合人绒毛膜促性腺激素（HCG）造模法制备PCO模型大鼠。随机分为对照组、PCO模型组（模型组）、PCO模型组+助孕胶囊组（中药组）、PCO模型组+克罗米酚组（西药组），运用放免法测定血清性激素水平的变化；光镜观察卵巢、卵泡发育的影响，免疫组化学法检测卵巢组织肿瘤坏死因子α表达水平。结果 助孕胶囊可使PCO大鼠的颗粒细胞层增厚,卵泡膜细胞层变薄，血清Ｔ、LH水平均明显下降，并下调卵巢组织肿瘤坏死因子α的表达。结论 助孕胶囊能够通过调整内分泌及影响卵巢肿瘤坏死因子α的表达，在中枢及卵巢局部协调发挥作用，从而调整性腺功能，促进卵泡的发育成熟及排卵。

【关键词】  多囊卵巢综合征；助孕胶囊；性激素；肿瘤坏死因子α；大鼠；紫河车；仙灵脾

    〔Ａｂｓｔｒａｃｔ〕 Ｏｂｊｅｃｔｉｖｅ To observe the effect of Zhuyun capsule(ZYC) on expression of genital endocrine hormone and tumor necrosis factor-alpha(TNF-α) in PCO rats, and investigate therapeutic actions and possible therapeutic mechanism of the capsule. Methods The PCO rat models, prepared by pregnancy hormone combine with human chorionic gonadotrophin(HCG), randomly divided into four group as control, model, Chinese crude drug(CCDG) and western medicine group(WMG); The levels of serum gonadal hormone were detected by radioimmunoassay; The effects of ZYC on ovaries and ovarial follicular development were observed by light microscope; And the expression level of TNF-α was detected with the immunohistochemical staining technique. Results ZYC could increase the thickness of granular cell layer and decrease the thickness of theca cell layer, greatly decrease the level of T and LH in serum and the expression of TNF-α in rat ovary. Conclusion ZYC can function regulating the endocrine and affecting the expression of the TNF-α coherently in center and ovary to adjust genital gland and promote the mature and ovulation of follicular.

    〔Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ〕 polycystic ovarian syndrome; Zhuyun capsule; gonadal hormone; TNF-α; rats; placenta hominis; Herba Epimedii

    多囊卵巢综合征（PCOS）是一组发病多因性、临床表现多态性的综合征，以雄激素过多和持续性无排卵为临床特征。中药调经促排卵临床疗效确切，助孕胶囊为临床经验方，对PCOS、各种无排卵及排卵障碍导致的月经不调、不孕不育有较好的疗效。本试验通过建立PCOS大鼠模型，研究助孕胶囊对PCOS大鼠性激素水平、卵巢卵泡发育及TNF-α表达的影响, 现从分子生物学水平及卵巢局部分析其可能的作用机制，为中药调经助孕提供的依据。

    1 材料与方法

    1.1  材料

    1.1  动物  健康SD雌性大鼠，24 d龄，体质量50 g左右，由西安大学医学院动物实验中心提供。

    1.1.2  药物  中药助孕胶囊由西安交通大学医学院第二附属中药制剂室提供药物，0.4 g/胶囊，1 g胶囊含生药1.575 g；克罗米酚（CC）由上海衡山药业有限公司生产，产品批号040301，50 mg/粒。

    1.2  方法

    1.2.1  模型制备  参照K.Bogovich[1]、朱辉等[2]的方法，选用24 d龄未成年雌性SD大鼠, 皮下埋植左旋18-甲基炔诺酮硅胶棒(3 mm), 在27 d龄时每日2次皮下注射1.5 IU HCG, 正常对照组每日2次皮下注射注射用水，共注射9 d。37 d龄连续阴道细胞涂片2个性周期。采血,测雄激素（T）、胰岛素（INS）水平。观察到阴道角化细胞持续出现及结合血清T、INS测定,符合标准者作为PCOS大鼠模型,不符合者剔除。对照组连续阴道细胞涂片2个性周期全部呈现完整的动情周期,血清T、INS测定在正常范围。

    1.2.2  动物分组  共分4组，正常对照组10只。PCO模型自47 d龄起，称体质量，分组观察。将30只模型大鼠随机分为模型组、助孕胶囊组（简称中药组）、CC组（简称西药组），每组10只。

    1.2.3  给药方法　 中药组按助孕胶囊生药6 g/（kg·d），西药组按人与大鼠公斤体质量折算系数给药，剂量20 mg/（kg·d）。对照组和模型组大鼠同期灌服同体积蒸馏水1 mL/100 g体质量，各组1次/d，共14 d。

    1.2.4  血清学测定  末次给药后24 h，2%戊巴比妥钠0.3 mL腹腔麻醉，打开腹腔，腹主动脉取血,离心、分离血清, 采用放射免疫法检测血清性激素(FSH、LH、E2、T)水平，由西安交通大学第二医院放免检验科按操作程序测定,批内批间误差<10%。性激素放射免疫分析药盒购自拉尔文生物工程技术有限公司。

    1.2.5  病理形态学观察  双侧卵巢大体解剖观察，并取下双侧卵巢组织、用10%的甲醛液固定，常规石蜡包埋、切片，待做HE染色及免疫组织化学分析，光镜观察卵巢的组织形态改变、卵泡的大小发育情况。

    1.2.6  TNF-α表达的SP免疫组化染色  应用免疫组化SP法检测卵巢组织LIF表达。SP试剂盒和LIF单克隆抗体购自福州迈新生物技术开发公司，应用DAB显色，均进行抗原修复、HE染色，切片厚4 mm，并行阴性和阳性对照。免疫组化结果判定：阳性染色为棕黄色颗粒，特异性位于细胞膜周围。对综合染色强度和分布范围进行半定量评分，评分标准：阴性为0分；染色弱但明显强于阴性对照者为1分；染色清晰者为2分；染色强者为3分。阳性细胞数者为0分；<10%为1分；20%～30%为2分;>30%为3分。上述两种评分相加为表达强度评分。

    1.3  统计学分析

    所有数据均以均数±标准差（ｘ±ｓ）表示，各测量值间的比较用方差分析。

    2 结果

    2.1  助孕胶囊对大鼠卵巢发育形态学的影响

    　对照组镜下见多个黄体及不同发育阶段的卵泡，初级卵泡位于浅层，数目较多，体积小，呈圆形或椭圆形。生长卵泡大小不一，位置较深，成熟卵泡多位于浅表部，可见卵泡腔、卵细胞及卵丘结构。颗粒细胞呈多层(多为6～8层)，形态完整，排列整齐，卵泡膜细胞呈梭形排列；模型组镜下见卵泡颗粒细胞减少而膜细胞层增加，后者常发生黄素化，卵巢皮质间质细胞明显增生，其中可见散在丛状的黄素化细胞巢；西药组在镜下仍可见黄素化的膜细胞层增加，卵巢皮质间质细胞增生，同时可见皮质内出现许多初级卵泡、生长卵泡及少量成熟卵泡，颗粒细胞层数增加，泡膜细胞层变薄，黄体组织数量较模型组明显增多；中药组镜下可见皮质内大多数卵泡为正常发育的卵泡，有初级卵泡、生长卵泡及成熟卵泡；颗粒细胞层数明显增加，约为4～5层，形态完整，排列整齐；泡膜细胞层明显变薄，黄体组织数量较模型组明显增多。