凹叶厚朴茎段愈伤组织诱导中的褐变控制研究

【摘要】  目的 研究愈伤组织诱导过程中的褐变问题。方法：将采集的标本进行外植体灭菌法再接种到培养基，在培养基中加抗褐变剂，进行防褐变试验。结果 外植体在4 ℃冰箱冷藏48 h的预处理对褐变有较好的控制效果。在培养基中加入抗褐变剂比加入吸附剂抗褐变效果好，抗褐变剂中Vc的效果最佳，吸附剂PVP比活性炭好。结论 培养条件，以低温遮光处理效果较好，光、温两个因素中，凹叶厚朴对光敏感，遮光能有效抑制褐变。液体浅层静置培养10 d后转入固体培养抗褐变的效果比单纯的固体培养效果好。

【关键词】  凹叶厚朴；茎段；愈伤组织；褐变控制；冷藏外植体；抗褐变剂；吸附剂；液体浅层静置培养

    〔Ａｂｓｔｒａｃｔ〕 Ｏｂｊｅｃｔｉｖｅ To study the brown staining of Maganolia biloba （Rehd et Wils）cheng stem fragments as explants during inducing the callus. Method The explant was sterilized and inoculated in a culture medium in which the anti-brown staining agent was added. Results The pretreated explants in 4 ℃ for 48 h were effective to control brown staining; The anti-browning agent added into the medium were better than the adsorbents into medium; Vitamin C was the best material in all anti-browning stain agents, and the adsorbent PVP was better than active carbon. Conclusion The low-temperature is effective for the tissue culture conditions, Maganolia biloba （Rehd et Wils） cheng is sensitive to light compared with temperature factors,and the culturing effects of the explant are more effective in the shallow-liquid static culture for 10 days, compared with that in the solid only culture.

    〔Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ〕 Maganolia biloba （Rehd et Wils）cheng; stem fragment; callus; browning control； refrigerating explants; anti-browning materials; adsorbent; shallow-liguid static culture    凹叶厚朴Maganolia biloba （Rehd et Wils） cheng为木兰科植物，以干燥根皮及枝皮入药，有燥湿消痰、下气除满功效，用于湿滞伤中、消化不良、呕吐泻痢、痰饮咳喘等病症。近年来，凹叶厚朴野生资源濒临枯竭，已被列为国家Ⅲ级保护植物。刘贤旺等[1]对凹叶厚朴进行了组织培养及愈伤组织超低温保存的研究，为凹叶厚朴的资源再生和种质保存提供了宝贵的技术资料和理论依据。在此基础上开展试验，发现在凹叶厚朴茎段组织培养过程中，褐化现象严重，需要多次转瓶才能诱导出愈伤组织。鉴于此，笔者专门针对凹叶厚朴茎段组织培养中出现的褐变现象进行了一系列比较试验，现报道如下。

    1 材料与方法

    1.1  外植体及培养基

    4月底采自湖南省森林植物园，以嫩枝顶芽及稍下的茎段作外植体。愈伤组织的诱导采用刘贤旺的实验结果，即：B5+2，4-D2 mg/L+6-BA1 mg/L+蔗糖30 g/L，pH 5.8~6.0。每次处理10瓶，每瓶5个外植体，外植体大小约为0.6 cm×0.6 cm。

    1.2  方法

    1.2.1  外植体灭菌  预处理后的材料用75%乙醇消毒30 s，再用0.1%升汞溶液浸泡10 min，无菌水冲洗4次，吸干，在PVP 1 g/L溶液中切割，接种到培养基上。

    1.2.2  防褐化试验  分4个方面分别进行，即：外植体预处理、培养基中加入防褐变剂或吸附剂、培养条件、固体培养和液体浅层静置培养后再固体培养。外植体预处理：用洗衣粉清洗，自来水冲洗1 h，沥干后，保鲜膜密封置于4 ℃的冷藏箱分别冷藏24、48 h，设对照为不冷藏。培养基中加抗褐变剂和吸附剂试验：培养基中加入Vc（10 mg/L）、LH（1 g/L）、巯基乙醇（1 mL/L）、PVP（1 g/L）、活性炭（2 g/L）。培养条件试验：①低温遮光处理（20 ℃，遮光20 d后，转入25 ℃及光下，光强1 500 LX）；②遮光处理（25 ℃，遮光20 d，转入25 ℃及光下，光强1 500 LX）；③对照(25 ℃，每天光照10 h，光强1 500 LX）。培养基：固体培养，在配好的培养基中加入6.5 g/L的琼脂；液体浅层静置培养，不加琼脂，瓶内培养基深度约为0.4 cm，培养10 d后，转入固体培养基中。方法：

    诱导率=（形成愈伤组织的外植体块数/接种的外植体块数）×100%。

    褐变率=（褐变的外植体块数/接种的外植体块数）×100%。

    2 结果

    2.1  外植体预处理对褐变的影响

    由表1可看出预冷处理有降低褐变的效果，使褐变率从对照的45%降低为30%~35%。冷藏时间48 h比24 h好。

    2.2  培养基中加抗褐变剂和吸附剂对褐变的影响

    表2结果看出，抗褐变剂和吸附剂能很明显的防止外植体的褐变，而且抗褐变剂的效果比吸附剂好，前者褐变率为10.5%~18%，后者达到20.5%~25.5%。

    2.3  培养条件对褐变的影响

    表3实验中，低温遮光处理与遮光处理的抑制褐变率相差不大，而两者与对照比较，都有较大的差异。由表3的结果看来，在 20~25 ℃之间，凹叶厚朴茎段愈伤组织的诱导对温度要求不严格，而对光敏感。

    2.4  固体培养基和液体浅层静置培养

    由表4的结果来看，液体浅层静置培养一段时间后再转入固体培养基中比单纯固体培养基中的效果要好。

    3 结论

    本文从4个方面考察了不同处理对凹叶厚朴茎段诱导愈伤组织中褐变的影响：（1）外植体在4 ℃冰箱冷藏48 h的预处理对褐变有较好的控制效果，这可能与低温状态下，细胞内多酚氧化酶活性降低以及酚类化合物合成减少有关。（2）在培养基中加入抗褐变剂和吸附剂，抗褐变剂的效果比吸附剂好，抗褐变剂中Vc的效果最佳，其作用机制主要是通过将多酚氧化酶（PPO）作用下形成的醌类物质重新还原为酚而减轻褐变[2]61-62，这与前人的试验结果一致[3]。PVP是酚类物质的专一性吸附剂，在生化制备中常用作酚类物质和细胞器的保护剂[4]16-17，防止褐变的效果比无机吸附剂活性炭好。（3）培养条件以低温遮光处理效果较好，光温两个因素中，凹叶厚朴对光敏感，遮光能有效抑制褐变，这可能是在黑暗条件下，阻断了酚类物质的生化合成途径，降低了酚类化合物的含量，同时抑制了PPO活性，减轻了酚类物质的氧化有关[4]18，光照会提高PPO的活性，促进酚类物质的氧化。温度对褐变造成的影响有两个方面的原因：较低的温度有利于伤口的愈合；另外，会降低PPO的生物活性，从而减轻褐变[2]63。（4）液体浅层静置培养10 d后转入固体培养比单纯的固体培养效果好，前期的液体浅层静置培养使伤口处外溢的酚类物质能迅速扩散到培养液中去，减轻了醌类物质在外植体四周的聚集，自体抑制效应减弱。

【】
  [1] 刘贤旺，杜 勤，赖学文.凹叶厚朴组织培养的研究[J].江西林业科技，1997，（2）：1-4.

[2] 于守超,赵兰勇,王 芬，等.植物组织培养中外植体褐变机理研究进展[J].山东林业科技，2004，(5).

[3] 苏梦云,姜景民.乐东拟单性木兰茎段愈伤组织诱导与褐变控制的研究[J].林业研究，2004,17(6):757-762.

[4] 崔堂兵,郭 勇,张长远.植物组织培养中褐变现象的产生机理及克服方法[J].广东农业科学，2001，(3).