深圳哈萨克族移民DNA氧化性损伤与修复的比较研究

             作者：柯跃斌，程锦泉Δ，帅志红，邓三毛，谭春荣，何彩，吴元良 

【摘要】  目的 比较研究来深圳不同年份的新疆哈萨克族居民的DNA 氧化损伤作用，从而探讨移民对DNA 氧化损伤的影响。 方法 选取60个深圳的新疆哈萨克族居民, 按来深圳不同年份分为3组(每组20人), 调查其移民后主要生活方式的变化情况；采静脉血做彗星实验,收集24h尿测定8-OH-dG。 结果 彗星实验显示,来深圳3～年组DNA损伤程度比～1年组均显著降低(P<0.05)；8-OH-dG测定结果显示,移民1～3年组的8-OH-dG水平低于～1年组(P<0.05)，移民3～年组的8-OH-dG水平明显低于～1年组(P<0.01)。 结论 移民的相关生活方式变化可能具有降低哈萨克族居民的DNA 氧化损伤的作用。

【关键词】  移民; 哈萨克族; 彗星试验; 8-羟基脱氧鸟苷

    【Abstract】  Objective  To explore the relationship of migration and oxidative DNA damage by comparative study of oxidative DNA damage effects of different migration years of Xinjiang Kazak ethnic migrants in Shenzhen.  Methods  Sixty Kazak ethnic people in Shenzhen were selected, and were divided into three groups (n =20) according to their migration years, the major changes of their life style were investigated. 8-hydroxy- 2’-deoxyguanosine(8-OH-dG) levels in urine were analyzed, and comet assay of peripheral blood lymphocytes was conducted.  Results   Compared with migration ～1 year group, a significant decrease of DNA damage assay in migration 3～ years group was observed (P<0.05). The 8-OH-dG level decreased significantly in migration 1～3 years group (P<0.05) and migration 3～ years group (P<0.01).  Conclusion  The results suggested that life style changes related to migration might reduce DNA damage in Kasake nationalities.

    【Key words】  migration; Kazak ethnic; comet assay; 8-OH-dG

    环境因素能影响机体活性氧自由基的产生，氧自由基损伤DNA等生物大分子,DNA氧化损伤与某些癌症有关［1,2］。目前对DNA氧化损伤的检测可分为直接检测DNA损伤的彗星试验方法，可测量DNA单链断裂,间接检测方法较常用的指标是测定尿中DNA氧化产物8-羟基脱氧鸟苷（8-OH-dG）。

    移民流行病学（migrant epidemiology）是通过观察某种疾病在移民人群、移居地当地人群及原居住地人群的疾病发病率或死亡率差别，以探索该病发生与遗传和环境关系。新疆食管癌发病率以哈萨克族最高，且远高于其他民族的患癌率。食管癌的发生可能与DNA氧化损伤有关。而深圳是座移民城，本研究拟比较来深圳不同年份的新疆哈萨克族居民的DNA 氧化损伤作用特点，通过分子流行病学分析，从而探讨某些环境因素在哈萨克族食管癌发病中的作用。

    1  对象与方法

    1.1  研究对象  研究对象为移居深圳的60名健康新疆哈萨克族男性居民,年龄16～35岁,每天吸烟量为5～20支，烟龄在4年以上。研究对象之间膳食相似,职业接触、生活居住环境和体力活动相似。

    1.2  方法  按移民到深圳的年限分为三组,即移民～1年组、移民1～3年组和移民3～年组。每组各20名。首先调查三组研究对象的主要生活方式（饮食习惯）随移民时间的增长有哪些方面的改变。再将60名研究对象根据其吸烟史、吸烟量和年龄按移民的年限进行分层分析吸烟对本研究是否有影响。由于移民～1年组大部分从新疆来深圳不长，其中15人迁居时间在半年以内，可把移民～1年组看作对照组。在相同条件下分别采集三组研究对象空腹静脉血1ml,用肝素抗凝,分离淋巴细胞用于彗星试验。并收集24h尿液，用于测定8-羟基脱氧鸟苷(8-OH-dG)，并测定尿肌苷。

    1.2.1  彗星试验  采用碱性单细胞凝胶电泳试验,基本参照中提供的方法进行,电泳结束后,琼脂糖凝胶片用乙醇脱水干燥保存。胶片经EB 染色后在荧光显微镜下观察并拍摄照片,结果判定使用国产单细胞凝胶电泳分析软件IMI 1.0 进行, 每人各分析50个淋巴细胞的Olive尾矩(尾部DNA%与电泳距离的乘积)和尾长与头长比(尾长/头长)。

    1.2.2  8-OH-dG的测定  用酶联免疫吸附实验(ELISA) 法测定8-OH-dG,试剂盒购于美国OXIS 公司,操作方法按照说明书的标准操作规范进行。

    1.3  统计学方法  统计分析应用SPSS软件。多组间例数比较用χ2检验(精确概率法 Fisher’s Exact Test)；三组间定量数据比较用方差分析,两组间比较采用SNK法，以α=0.05为检验水准。

    2  结果

    2.1  研究对象的一般情况  三组研究对象的年龄、吸烟量和吸烟史经检验差异无显著性(见表1)。表1  研究对象的一般情况调查结果注： 三组之间两两比较, 均P>0.05

    2.2  移民后主要生活方式（饮食习惯）的变化情况   三组研究对象的主要生活方式（饮食习惯）则随移民时间的增长有许多方面的改变，包括吃熏烤肉类、吃烤烙饼类、吃蔬菜等饮食习惯有很大变化，经检验差异有显著性(见表2)，移民时间越长差异越大。但是喝奶茶和吸烟等习惯基本没有改变，经检验差异无显著性。表2  不同移民时间与主要饮食习惯的变化情况 注：与对照组移民～1年组比较,  *P < 0.05 ,**P < 0.01

    2.3  对外周血淋巴细胞彗星试验的影响  移民1～3年和3～年组的彗星的尾矩和尾长/头长均低于对照组,其中移民3～年组与对照组的差异有显著性；与移民～1年组相比, 移民3～年组彗星的尾矩和尾长/头长均显著性降低(见表3)。表3  三组人群彗星试验结果比较注：与对照组移民～1年组比较,  *P < 0.05

    2.4  尿中8-OH-dG的测定结果  三组人群尿8-OHdG(x±s)的测定结果分别为：24.15±3.12(ng/mg肌酐)、21.94±2.02(ng/mg肌酐)、14.92±2.61(ng/mg肌酐)，移民1～3年和3～年组的8-OH-dG水平低于移民～1年组，经统计学检验差异有显著性。与移民～1年组相比，其中移民3～年组的8-OH-dG水平降低更为明显，经检验差异有显著性，P<0.01(见图1)。注：移民1～3年与对照组移民～1年比较，P<0.05；移民3年～与对照组移民～1年比较，P<0.01

   3  讨论

    氧自由基可以攻击DNA链上的鸟嘌呤碱基使C-8位发生羟化而生成加合物羟基脱氧鸟苷(8-hydroxy-2’-deoxyguanosine, 8-OHdG),后者是DNA氧化损伤的主要产物之一。在复制过程中,DNA链上8-OHdG可以与C以外的其他碱基配对形成点突变,其中GC→TA突变的发生已为大量研究所证实,并被认为是氧化应激因素致癌、致突变的主要机理之一［1,2］。目前机体8-OHdG水平已被广泛接受为DNA氧化损伤的标志物,并用来估计氧化应激相关癌症发生的危险性［3］。

    机体在氧化应激因素的作用下，出现DNA 单链断裂和8-OHdG水平的增高，提示机体发生癌症的危险性增加。然而机体DNA 单链断裂和8-OHdG水平受多种疾病影响，吸烟、石棉作业以及辐射［4,5］等也能影响其水平。因此本研究首先在选取60名研究对象时严格排除上述因素（其他疾病、有害作业）的影响。从表1可见三组人群的年龄特征和吸烟等情况没有显著差异。这样才能探讨移民饮食因素对DNA 氧化损伤的影响。

    DNA 氧化损伤是导致癌症等慢性疾病的重要途径。目前对DNA 氧化损伤的检测可分为直接和间接两方面的检测, 直接检测DNA 损伤比较常用的方法是测量DNA 单链断裂,即彗星试验。间接检测DNA 氧化损伤较常用的指标是测定尿中8- 羟基鸟嘌呤核苷酸, 8-羟基鸟嘌呤核苷酸的形成机制是羟自由基在DNA 碱基的C-4、C-5 或C-8 位置上与脱氧鸟嘌呤核苷酸残基结合形成8- 羟基-7,8-二羟基鸟嘌呤核苷酸, 该物质又可进一步氧化生成8-羟基脱氧鸟嘌呤核苷酸。正常情况下,8-羟基鸟嘌呤核苷酸在DNA 修复机制的作用下被及时剪切,形成8-羟基脱氧鸟苷随尿液排出体外。研究表明,环境污染高暴露个体尿中的8-OH-dG显著升高, 尿中的8-OH-dG 和人体接触致癌物的浓度成剂量-反应关系［5,6］。

    移民流行病学是通过观察某种疾病在移民人群、移居地当地人群及原居住地人群的疾病发病率或死亡率差别，以探索该病发生与遗传和环境关系。它是利用移民人群研究疾病的分布，从而找出疾病原因的一种研究方法，是地区、人群、时间分布综合描述疾病的一个典型实例。已用于肿瘤、慢性病和一些遗传的病因研究中。移民流行病学对探寻肿瘤病因和预防策略非常有价值。移民分子流行病学研究在美国、澳大利亚等国家很受重视［7,8］。深圳是座移民城，拥有全国的56个民族，具有得天独厚的研究条件。新疆食管癌发病率以哈萨克族最高，且远高于其他民族的患癌率。食管癌的发生可能与DNA氧化损伤有关［9,10］。来深圳的少数民族移民在饮食习惯等生活方式及生活环境等方面都与在原居地有很大差异，移民时间越长改变越多。

    移民的环境因素改变非常复杂,主要包括因素和社会因素,而对其DNA 氧化损伤有潜在影响的因素主要是饮食习惯,因为根据我们的前期调查,基本可以排除职业和室内装修等有害暴露的影响。与饮食习惯有关的暴露指标难以选择，我们采用移民时间来比较分析其时间-效应关系。

    本研究调查发现，深圳的新疆哈萨克族移民的主要生活方式（饮食习惯）则随移民时间的增长有许多方面的改变，包括吃熏烤肉类、吃烤烙饼类、吃蔬菜等饮食习惯有很大变化（表1）。这些改变可能对其DNA 氧化损伤有潜在影响。比较研究来深圳不同年份的新疆哈萨克族居民的DNA 氧化损伤作用，从而探讨移民对DNA 氧化损伤的影响, 揭示环境因素在哈萨克族食管癌发病中的作用。

    外周血淋巴细胞彗星试验结果表明，与移民～1年组相比, 移民3～年组彗星的尾矩和尾长/头长均显著性降低，提示来深圳后的饮食习惯等生活方式及生活环境等的改变可能减少了新疆哈萨克族移民的DNA 单链断裂。与此相类似，尿中8-OH-dG的测定结果表明，与移民～1年组相比，移民3～年组的8-OH-dG水平显著降低，提示来深圳后的饮食习惯等生活方式及生活环境等的改变可能减少了新疆哈萨克族移民的DNA氧化损伤。 我们过去的研究发现肉类烧烤接触人群尿中的8-OH-dG水平高于一般人群，与本研究是一致的，提示新疆哈萨克族吃熏烤肉类的习惯可能诱导其DNA氧化损伤。

    提示膳食中摄入足量的抗氧化营养素或额外的补充适量的这些营养素,可有效地清除体内氧自由基, 减少DNA的氧化损害。维生素A、E、C、天然β-胡萝卜素等是人体所需的重要营养物质［11,12］。这些营养物质的抗氧化作用与其补充剂量具有一定的关系。新疆哈萨克族在原居住地基本上是不吃蔬菜的，来深圳后吃蔬菜等饮食习惯的培养，可能减少了哈萨克族移民的DNA氧化损伤，本研究能反映这一点。

    本研究结果提示哈萨克族食管癌可能与其长期吃熏烤肉类、吃烤烙饼类、少吃蔬菜等饮食习惯所致的DNA氧化损伤有关。

    由于检测成本高，目标人群不易获得，本研究样本量显得不足，可能因此未发现移民与DNA 氧化损伤的时间-效应关系，进一步的研究可将各移民组与新疆哈萨克族在原居地居民和深圳汉族本地原居民人群检测数据进行比较分析。

【文献】
  1 Ari Barzilai, Ken-Ichi Yamamoto. DNA damage responses to oxidative stress. DNA Repair,2004,3:1109-1115.

2 Irie M, Miyata M, Kasai H. Depression and possible cancer risk due to oxidative DNA damage. Journal of Psychiatric Research. 2005, 39 (6): 553-560.

3 Kasai H, Svoboda P, Yamasaki S, et al. Simultaneous Determination of 8-hydroxydeoxyguanosine, a Marker of Oxidative Stress, and Creatinine, a Standardization Compound, in Urine. Industrial Health， 2005, 43, 333-336.

4 Besarati N, Van S, Schilderman De K, et al. A multi-biomarker approach to study the effects of smoking on oxidative DNA damage and repair and antioxidative defense mechanisms.Carcinogenesis,2001,3(22):395-401.

5 Irie M, Tamae K, Iwamoto-Tanaka N, et al. Occupational and lifestyle factors and urinary 8-hydroxydeoxyguanosine. Cancer Science， 2005, 96(9): 600-606.

6 Jee YK, Sutapa M, Long N, et al. Urinary 8-Hydroxy-2?- Deoxyguanosine as a Biomarker of Oxidative DNA Damage in Workers Exposed to Fine Particulates. Environ Health Perspect, 2004, 112:666-671.

7 Kulkarni K, Barcak E, El Serag H, et al.The impact of immigration on the increasing incidence of hepatocellular carcinoma in the United States. Aliment Pharmacol Ther,2004,20(4):445-450.

8 McCormack VA, Mangtani P, Bhakta D, et al. Heterogeneity of breast cancer risk within the South Asian female population in England: a population-based case-control study of first-generation migrants. Br J Cancer,2004,90(1):160-166.

9 Wu LL, Chiou CC, Chang PY, et al. Urinary 8-OHdG: a marker of oxidative stress to DNA and a risk factor for cancer, atherosclerosis and diabetics. Clin Chim Acta, 2004, 339, 1-9.

10 Poplawski T,Arabski M,Kozirowska D,et al. DNA damage and repair in gastric cancer--a correlation with the hOGG1 and RAD51 genes polymorphisms. Mutat Res, 2006,601(1-2):83-91.

11 Valkonen MM. Vitamin C prevents the acute atherogenic effects of passive smoking.Free Radic Biol Med,2000,28:428-436.

12 柯跃斌,庄志雄.几种营养素和食物成分的抗DNA氧化损伤作用.环境与职业医学，2006，23（6）：513-515.