沙鼠短暂性脑缺血及西比灵干预后脑内Smad2和Smad4表达的研究

【摘要】  目的 研究沙鼠短暂性脑缺血及西比灵干预后脑内Smad2和Smad4蛋白的表达。方法 制作沙鼠脑缺血再灌注模型，用免疫组化法检测脑内Smad2、Smad4蛋白的表达变化。结果 各组沙鼠神经元和胶质细胞胞浆内均有Smad2、Smad4蛋白阳性表达，且Smad4蛋白表达均显著强于Smad2蛋白。缺血再灌注6h、1天后Smad2、Smad4蛋白表达显著上调(P<0.05)。同脑缺血组相比，西比灵干预组20只沙鼠神经元和神经胶质细胞内Smad2和Smad4蛋白在缺血再灌注6h、1天时表达明显下调(P<0.05)。结论 沙鼠脑神经细胞和神经胶质细胞内均有Smad2、Smad4蛋白表达；西比灵干预后，缺血再灌注沙鼠脑神经细胞和神经胶质细胞内Smad2和Smad4蛋白表达下调。提示Smad2和Smad4蛋白可能是缺血性脑损伤程度的又一重要标志；Smad4、Smad2在沙鼠脑缺血的发生和过程中可能有协同作用。

【关键词】  Smad蛋白；免疫组化；缺血再灌注；沙鼠

    【Abstract】  Objective  To study the expressions of Smad2 and Smad4 protein of flunarizine on the expressions of  tissue following cerebral ischemic reperfusion in gerbil.Methods  A cerebral ischemia - reperfusion model in gerbils was established . The expressions of Smad2 and Smad4 protein in brain tissue were detected by using immunohistochemistry technique at the 6th hour, 1st day after ischemic reperfusion (IR).Results  Experimental results revealed that Smad2 and Smad4 protein were expressed in neurons and gliacytes of brain tissue in all gerbils, and expression of Smad4 protein is higher than that of Smad2 protein(P<0.05). Compared with normal control group, the expression of Smad2 and Smad4 protein in neurons and gliacytes of ischemic gerbils was evidently increased at the 6th hour, 1 day (P< 0.05).Compared with cerebral ischemia group, the expression of Smad2 and Smad4 protein in neurons and gliacytes of gerbils in flunarizine treatment group was evidently decreased at the 6th hour,1st day(P<0.05).Conclusion  Smad2 and Smad4 protein were expressed in neurons and gliacytes of brain tissue in gerbils; and the expression of Smad2 and Smad4 protein in neurons and gliacytes of gerbils in flunarizine treatment group were evidently decreased.Smad2 and Smad4 protein might be important factors of mark of brain injury following cerebral ischemic reperfusion.Smad2 and Smad4 protein may take on synergistic actions in normal brain tissue of gerbils and in the occurrence and development of signal transduction of cerebral ischemia gerbil.

    【Key words】  Smad；protein；immunohistochemistry；ischemia-reperfusion;gerbil

    体内外实验均证明，转化生长因子β有神经保护作用［1］。脑缺血后，脑组织内TGF-β表达增高，是机体对缺血性脑损伤的一种保护性反应［2］。TGF-β1增高能减少脑梗死面积，抵御脑缺血性损伤。Smad蛋白是辅助TGF-β超家族信号在细胞内传导的一族蛋白，包括了Smad2、Smad4等［3］；直接参与TGF-β超家族成员的信号传导，是TGF-β超家族成员参与生命活动的重要介质。我们通过免疫组化技术测定沙鼠正常脑组织；缺血再灌注后脑组织及西比灵干预后缺血再灌注后脑组织及Smad2/4转录水平的表达,初步发现了Smad2、Smad4之间的关系，现报告如下。

    1  材料与方法

    1.1  实验材料

    1.1.1  实验动物  健康雄性蒙古沙鼠60只，9月龄，体重（90±5）g，购自上海实验动物管理委员会。随机分为正常组、假手术组、脑缺血组及西比灵干预组。

    1.1.2  主要试剂  Smad2、Smad4免疫组化检测试剂盒，一抗(鼠IgG)，二抗(羊抗鼠IgG)，抗原修复液I，山羊血清封闭液、SABC等和DAB显色试剂盒均由武汉博士德生物工程有限公司提供；西比灵胶囊由西安杨森医药公司提供。

    1.1.3  主要仪器  石蜡切片机、免疫组化专用盖玻片(武汉博士德生物工程有限公司提供)、恒温箱、冰箱、显微镜、照相机等。

    1.2  实验步骤和方法

    1.2.1  动物模型的建立  健康雄性蒙古沙鼠，用3%戊巴比妥以30mg/kg的剂量腹腔注射进行麻醉，固定动物，消毒，颈正中切开皮肤1.5cm左右，钝性分离皮下组织，分离双侧颈总动脉，微血管夹夹闭双侧颈总动脉10min后松夹再灌注，缝合皮肤。

    1.2.2  动物的分组和处置  正常组10只，不予任何处理即断头处死动物。假手术组10只，仅分离双侧的颈总动脉，不予夹闭，就缝合皮肤，1天后断头处死。脑缺血组：共20只沙鼠，分为缺血6h组（IR6h）、缺血1天组（IRld）两组，每组10只，分别在缺血再灌注(IR)6h、1天时间点处死动物。西比灵干预组共20只沙鼠，分为IR6h,IRld两组，每组n=10，在缺血再灌注前一天给予喂食西比灵［按20mg/(kg·d)］。分别在缺血再灌注(IR)6h、1天时间点处死动物。所有实验动物在预定时间断头处死，快速取前脑置10%福尔马林固定,常规石蜡包埋后5μm连续切片。

    1.2.3  SMAD蛋白表达的检测  免疫组化:按常规SABC法进行，一抗的稀释度均为1：100。

    1.2.4  结果判定  病理结果采用相邻脑组织切片作常规HE染色，用光镜观察其组织病理变化，估计脑损伤程度。免疫组化取各组沙鼠断面水平相似的连续组织切片，所有切片分析均在同一强度、同一放大倍数下进行，每个指标采用阳性细胞计数法。在40×10倍的光镜视野下观察免疫反应，以细胞浆着棕褐色为阳性，每张切片在高倍视野下分别取上、下、左、右及中心共5个区域进行细胞计数, 每个区计数200个细胞, 共计数1000个细胞, 染色细胞所占比例，即为Smad2、Smad4表达指数。

    1.3  统计学分析  各组检测结果用单因素方差分析方法，2个独立样本用t检验，两变量间相关关系用直线相关分析，计算Pearson相关系数;确定P<0.05差异有显著性；所有统计分析均用SPSS11.0统计软件包完成。

    2  结果

    2.1  病理观察结果  正常组和假手术组皮层组织形态结构正常。脑缺血组IR6h可见部分神经元和胶质细胞轻度水肿；IRld后神经元出现变性、灶性坏死、胶质细胞轻度增生。西比灵组:IR6h、IRId各组分别同脑缺血组相应时间点相比，脑组织损伤程度均明显轻于脑缺血组。

    2.2  免疫组化结果  所有正常沙鼠脑组织神经元和神经胶质细胞内均有Smad2和Smad4蛋白不同程度的阳性表达，多呈棕黄色颗粒;颗粒主要定位于胞浆，部分定位于胞核。但表达程度有所不同，Smad4蛋白表达强于Smad2蛋白，统计差异有显著性(P<0.05)。在缺血再灌注沙鼠脑组织中，神经元和神经胶质细胞内也有不同程度的Smad2和Smad4蛋白的阳性表达，表达部位与正常组基本一致，Smad4蛋白表达也高于Smad2蛋白，统计差异有显著性(P<0.05)。缺血再灌注组（IR6h、IR1D）与正常组、假手术组比较，Smad2和Smad4蛋白阳性表达率增高，统计差异有显著性(P<0.05)。西比灵干预组Smad2和Smad4蛋白阳性表达率低于同时间点的脑缺血组，高于同时间点的正常对照组，统计差异均有显著性(P<0.05)（图1、2；表1）。表1  各组Smad2和Smad4蛋白表达指数比较 注：与正常对照组比较，▲P<0.05；与同时间点缺血组比较，△P<0.05；与各组Smad4蛋白比较，*P<0.05

    3  讨论

    Smad蛋白质群是近年来发现的新的细胞内信号传导蛋白，它们直接参与TGF-β超家族成员的信号传导［4］。目前已发现的Smad蛋白至少有10种，在哺乳动物中有8种，Smad1～Smad8。其中，参与调节TGF-β的Smads包括Smad1,2,3和4。Smad2由Eppert等于1996年从人肾cDNA文库中克隆获得，其C端含有SSXS结构，SSXS结构能被特异的丝氨酸激酶I型受体磷酸化，进而参与信号传导。Smad4C端不含SSXS结构，它不能特异地介导信号传导，但它能与Smad1,2,3,5和8等结合后协同激活各自的特异靶基因，因此也称为协同Smad；当TGF-β受体活化后，可以诱导限制途径Smad2和Smad3通过细胞膜特异的丝氨酸/苏氨酸激酶受体活化而发生磷酸化，再与共有型Smad4结合成寡聚体转运到细胞核，在细胞核直接地应答TGF-β的转录功能，这一结构是TGF-β细胞内信号的开关［5］。

    国内外已有研究Smad2和Smad4蛋白在心肌细胞、肝细胞、牙乳头细胞和胃癌等细胞和组织中有表达，但沙鼠脑组织中是否存在Smad2和Smad4蛋白表达尚未见报道。本实验用免疫组化方法检测到正常沙鼠脑组织神经细胞和神经胶质细胞胞浆和胞核内均有Smad2和Smad4蛋白表达，Smad4蛋白表达强于Smad2蛋白，两者差异有显著性。这表明Smad2和Smad4蛋白作为TGF-β在细胞内信号转导的分子，在于沙鼠神经细胞及神经胶质细胞中是必需的，神经细胞及神经胶质细胞需要Smad2和Smad4蛋白的表达才能发挥正常功能。而Smad4蛋白表达高于Smad2蛋白的可能原因是Smad4蛋白是TGFβ信号通路的共同通路有关。Smad2和Smad4蛋白在缺血再灌注6h，1天时沙鼠神经细胞、神经胶质细胞胞浆和胞核内也均有表达，且较正常沙鼠神经细胞、神经胶质细胞胞浆和胞核内的表达有明显上调，两者差异有显著性。进一步分析发现Smad2和Smad4蛋白在缺血第1天时间点表达比在缺血第6h时间点表达更明显(P<0.05)。脑缺血再灌注后Smad2和Smad4蛋白表达升高的可能原因我们认为是：脑缺血再灌注后，脑组织发生损害，氧自由基等有害物质表达增加，机体为了抵御这些有害因子，反应性地上调一些保护性因子，这其中就有TGF-β1。Smad2和Smad4蛋白是TGF-β1信号转导的必需分子，故当TGF-β1表达上调时，可能需要更多Smad2和Smad4蛋白来转导具有脑保护作用的TGF-β1的信号，而1天时TGF-β1表达较6h更高，Smad2和Smad4表达也相应增多。统计还发现，正常对照组、缺血组沙鼠脑神经细胞和神经胶质细胞内Smad4蛋白和Smad2蛋白表达存在正相关关系，其Pearson相关系数为0.582，这提示Smad4蛋白和Smad2蛋白在正常沙鼠脑组织内及脑缺血的发生和过程中可能有协同作用，这与目前大多数研究一致。西比灵是经典的钙离子拮抗剂，它有明显的脑保护作用。西比灵可有效的抑制神经细胞膜受体依赖性Ca2+通道开放，具有神经保护作用，并具有减轻皮质抑制，缩短恢复时间，防止脑组织缺血性改变的功能，增加脑组织对缺氧的耐受性。已有研究表明，西比灵发挥脑保护是通过以下机制实现的:西比灵可增加脑组织对缺氧的耐受性，有神经细胞保护作用；抑制病理性血管收缩，阻止血小板聚集，抗自由基作用，拮抗兴奋性氨基酸作用；改善脑循环，减轻脑水肿；避免再灌注性损伤［6］。由于Smad是TGF-β信号转导通路必需的，故阐明正常、缺血沙鼠脑组织内Smad4和Smad2蛋白的表达水平有助于加深对TGF-β胞内信号转导机制的理解，也有助于深入阐明脑缺血缺氧的发病机制，为其进一步深入分子水平的研究与治疗打下基础。

【文献】
  1 RuoccoA,NicoleO,DocagneF,et al.Increased express ion of TGF-β1in brain tissue after ischemic stroke in humans.Stroke,1996,27(5):852－857.

2 PrehnJH,MillerRJ.Opposite efects of TGF-β1 on r apidly-and slowly triggered excitotoxicin jury.Neuro pharmacology,1996,35 (3):249－256.

3 MassagueJ.TGF-β signal transduction.Annu Rev B iochem,1998,67:753-791.

4 Sekelsky JJ, Newfeld SJ,Reftery LA,et al.Geneticc haracter-rizationandcloning of mothers again std pp, agene required for decapen taplegic functionDrosophils melano gaster.Genestics, 1995,139:1347-1358.

5 Held in CH，MiyazonoK,tenDijkeP.TGF-beta singalling from cellmembraneto nucleusth rough SMAD proteins.Nature,1997，390(6659):465-471.