基因芯片技术检测利福平药物诱导 H37Rv株基因突变的应用研究

【摘要】  目的用利福平、异烟肼药物作用 H37Rv 株，诱导基因突变，用基因芯片技术检测耐药菌株突变基因位点。 方法 H37Rv 菌株用不同浓度的利福平和异烟肼加入培养液中观察菌株的耐药生长情况，耐药菌株用 PCR 扩增产物杂交，基因芯片检测药物作用部位是否有突变，检测突变基因位点。 结果利福平药物诱导H37Rv耐药，用基因芯片技术检测利福平耐药菌株，rpoB 基因 531 位发生突变，TCG 转变为 TTG，直接测序发现在相同 位点发生突变。耐异烟肼耐药菌株 katG 基因 315 位发生突变，AGC 转变为 ACC。同时加入两种药物的耐药株用基因芯片检测分别在 rpoB 基因 531位，katG 基因 315 位发生突变。结论结核分枝杆菌产生耐药的机理与药物作用基因位点突变有关。基因芯片检测技术耐药菌株基因突变，不仅可以准确地确定突变位点和突变类型，快速、高效、设备简单，并能同时检测分析成千上万个基因有关突变位点。

【关键词】  H37Rv 株；药物诱导耐药；DNA 芯片；突变基因

我国是世界上结核病发病率最高的 22 个国家之一，肺结核患者约有 600 万人，每年约有 25 万人死亡。世界卫生组织报警：肺结核日夺全球千人性命，在西太平洋地区每日有近 1 000 人死于肺结核，将削弱地区的增长，肺结核大部分患者年龄在 15 岁至 54 岁之间，是社会的主要劳动力。如果作为家庭经济支柱，经济有重要影响，在孟加拉国每 2 min 就有 1 人感染肺结核，每 10 min 就有 1 人死于结核病。结核病严重危害人类健康及经济的。结核病流行显示高患病率、高耐药率、低速降率等特点[1]，特别是抗结核药物的广泛应用及不合理的服药，结核杆菌产生高耐药，临床检测困难，耐药菌株存在作为传染源，对流行病的控制带来严重威胁。快速检测那部分耐药菌株，可为临床诊断提供可靠的依据。为了消除传染源，控制结核病的流行，我们用利福平等药物作用于结核菌，用基因芯片技术检测耐药菌株的基因变化，有快速高效的应用效果，现报道如下。

    1    材料和方法

    1.1    材料和仪器

    1.1.1    全自动血培养仪    Esp c   lture systemⅡ。

    1.1.2    结核菌培养液    Esp myco 培养瓶，12.5 mL/ 瓶，美国 TREK Diagnostic systems Inc 生产。

    1.1.3    生物安全柜    Fx1200-Ⅱ-A/B，上海瑞仰净化设备有限公司。

    1.1.4    煮沸箱。

    1.1.5    Lightcycler 荧光 PCR 仪。

    1.1.6    Generalscanning 芯片信息系统 Scannarray 3000 扫描仪。

    1.1.7    基因芯片    由中科院上海信息系统和微技术研究所，宁波瑞芯生物科技有限公司生产。

    1.1.8    引物    正向 CAG GAC GTG GAG GCG ATC 18 bp；反向 C GCT CAC GTG ACA GAC CG 18 bp；由上海生工工程技术服务有限公司合成。

    1.1.9     H37Rv 菌株购自药品生物制品检定所

    1.1.10    利福平﹑异烟肼购买。

    1.2    方法

    用利福平﹑异烟肼药物诱导作用 H37Rv 菌株。

    1.2.1    H37Rv 菌株在无菌生物柜中打开，用无菌生理盐水稀释，抽取 0.5 mL 接种。Esp myco 培养基中置 Esp culture system Ⅱ 培养仪培养，3 周后见细菌生长，继续培养 1 周后取培养液 0.5 mL 分别接种于 Esp myco 培养基中，置培养仪培养，培养 2 周后见各瓶有细菌生长。

    1.2.2    用利福平加入培养悬液中诱导作用于细菌。利福平 0.15 g/粒，用无菌生理盐水 10 mL 溶解呈 150 mg/10 mL，抽取 1 mL=15 mg/mL 利福平加 9 mL 生理盐水，即呈 1.5 mg/mL，即 1 500   g/mL 利福平。

    1.2.3    取 1 500   g/mL 利福平 2 mL 加入培养液中，浓度呈 240   g/mL 利福平。取 1 500   g/mL 利福平 0.4 mL 加入培养液中，浓度呈 48   g/mL 利福平。取 1 500   g/mL 利福平 0.4 mL 加入培养液中，浓度呈 4.8   g/mL 利福平。依据 WHO 公布的标准：细菌在含 40~50   g/mL 利福平培养基上可以生长为耐药。

    1.2.4    用异烟肼加入培养悬液中作用诱导细菌    异烟肼 100 mg/ 片，溶于 10 mL 无菌生理盐水中即 100 mg/10 mL；取 1 mL 加水 9 mL 稀释浓度呈10 mg/10 mL；取1 mL 加水 9 mL 稀释浓度呈 1 mg/10 mL，即 1 000   g/10 mL，100   g/mL；取 1 mL 加水 9 mL 稀释浓度呈 10   g/mL；取 1.4 mL 10   g/mL 利福平加入培养基菌液中呈 1   g/mL 异烟肼浓度。取 1.4 mL 100  g/mL 利福平加入培养基菌液中呈 10   g/mL 异烟肼浓度。取 0.7 mL 100   g/mL 利福平加入培养基菌液中呈 5   g/mL 异烟肼浓度。耐药标准 1~10   g 异烟肼在培养基上仍能生长。

    1.2.5    培养基悬液中分别加入含 5   g/mL 异烟肼，48   g/mL 利福平的培养基悬液；配制成含 10   g/mL 异烟肼，248   g/mL 利福平的培养基悬液作用诱导细菌。

    以上 1.2.3，1.2.4，1.2.5 配制含不同药物的培养基置培养仪培养观察结果。

    1.2.6    培养物含不同药物浓度经 70 d 后仍能生长的细菌培养液。分别取耐 48   g/mL 利福平﹑5   g/mL 异烟肼﹑48  g/mL 利福平和 5   g/mL 异烟肼菌液作测定。据有关报道，异烟肼耐药标准 1  g/mL 和 10   g/mL 分别为低浓度和高浓度耐药[2]，WHO 公布的标准细菌在含 40~50   g/mL 利福平培养基上可以生长判定为耐药。H37Rv 原菌培养液作对照。用煮沸裂解法提取 DNA，将抽提液用聚合酶链反应扩增所需目的 DNA 片段。引物由上海生工生物工程服务公司合成，rpoB 基因引物：上游引物 5＇-CAG GAC GTG GAG GCG ATC-3＇下游引物：5＇-C GCT CAC GTG ACA GAC CG-3＇，序列号 515684，rpoB 基因 794-1974，目前国际国内研究突变基因相关区域。katG 基因引物 1.5＇-CAC TTT CGG TAA GAC CCA TGG C-3＇，2.5＇-TAT TGC CAA GCG CCA GCA GG-3＇。rpoB 基因，聚合酶链反应程序，扩增体系 25   L，取制备好的 DNA 样品 2   L，PCR 反应液 Buffer 3   L，dntp 2.5 mmol/L 2   L，Taq 聚合酶 2  L，Mg2+ 2.5 mmol/L 2   L，10pmmol/mL，引物 1、2 各 0.75   L。加水 12.5   L。聚合酶链反应程序：首先将标本预变性 94℃ 4 min，再以 94℃ 30 s，60℃ 30 s，70℃ 30 s 循环 35 次。再后 72℃ 延伸 4 min，置 2~8℃ 保存。KatG 反应体系：50  L。Buffer 5   L；2 mmol/L MgCl 4   L；dntp 5   L；引物 1 20   mol/L 1   L；引物 2  20   mol/L 1   L；Tap 聚合酶 5 g/l 0.4   L；模板 5   L；H2O 28.6   L。反应程序：首先 94℃ 3 min 预变性，然后以 94℃ 1 min，64℃ 1 min，72℃ 1 min，35 个循环，再后以 72℃ 5 min 延伸，置 2~8℃ 保存。

    1.2.7    聚合酶链扩增产物由中科院上海信息系统和微技术研究所宁波瑞芯生物制品有限公司用基因芯片技术进行基因测序及基因突变分析。 H37Rv 对照样本及耐药菌株的扩增产物，用基因芯片序列测定。该芯片包括：511，513，514，516，526，531，532 和 533 位密码子突变在内的 30 种单核苷酸变态性。还包括 katG 基因 282~387 位密码子。

    2    实验结果

    2.1    培养结果观察

    含异烟肼 5   g/mL 培养基在 35 d，70 d 仍见细  菌生长。含利福平 48   g/mL 培养基在 21 d，35 d，70 d 仍见细菌生长。含利福平 48  g/mL 和异烟肼 5   g/mL 培养基在 21 d，35 d，70 d 仍见细菌生长。

    2.2    基因芯片检测结果

    2.2.1    H37Rv 株基因芯片测序及直接测序为野生型。

    2.2.2    H37Rv 利福平耐药株基因芯片检测发现531 位基因发生突变。TCG 突变为 TTG。

    2.2.3    利福平加异烟肼作用 H37Rv 株耐药发现531 位、315 位均发生突变。TCG 突变为 TTG  AGC 突变为 ACC。

    2.3    直接测序结果

    2.3.1    H37Rv 株用测序仪直接测序未见突变基因。

    2.3.2    利福平作用 H37Rv 株见 531 位发生突变。TCG 突变为 TTG。

    2.3.3    异烟肼作用 H37Rv 株见 315 位发生突变。AGC 突变为 ACC。

    3    讨    论

    抗结核药物的诞生拯救了无数结核病患者的生命，对结核流行病的控制发挥了巨大作用。但随着药物的滥用及不正规使用，结核菌应对环境的生存条件，对一些药物产生耐药，无论细胞膜或细胞核都会发生变异。菌株能变异成颗粒状，抗酸性阴性或减弱。研究发现 DNA 发生突变，是药物作用部位的遗传基因发生改变而产生耐药。实验用利福平诱导 H37Rv 株发现 DNA531 位碱基发生突变：TCG→TTG，产生耐药，且仍具生命。利福平药物的作用是通过细菌 DNA 聚合酶β亚基结合，抑制转录起始和 RNA 的延伸，起到杀菌作用。这个结合位点是由不同 RNA 聚合酶亚单位上关键氨基酸的改变而导致其构象的改变，从而使药物结合位点缺失[3]。 rpoB 基因是细菌 RNA 聚合酶β亚基的编码基因，全长 3 543 个碱基，现研究发现其中长 81 个碱基的核心区易发生突变，利福平不能与 RNA 聚合酶亚基结合因而细菌产生耐药，这与 Garoial 等的结果相似[4]。我们的实验结果发现 531 位发生突变与国外报道相符。

    目前国内外研究证明 90%~95% 的结核分枝杆菌耐利福平菌株存在 rPOB 基因突变，而且这些突变集中于核心区域内包括 507~533 位是耐利福平的决定区。

    异烟肼作用 H37Rv 株诱导结果发现 DNA315 位碱基发生突变。近年来国内外学者的大量研究认为异烟肼实际上是一药物前体，需经 mtb 过氧化氢- 过氧化酶（katG）活化后才发挥抗结核作用，而过氧化氢-过氧化酶正是由 katG 基因编码的[5]。在对耐INH 的临床分离株中，3 株菌种有 2 株存在 katG 基因片段的缺失，他们认为 katG 基因的缺失是 mtb，INH 耐药的共同机理[6]。国内吴雪琼、胡忠义等研究证明  katG 基因突变在 315 位密码子。目前，我国对 katG 基因的分析多集中于 282 bp 与 237 bp 突变区域，这些区域的变异可在 2/3 的耐药菌株中观察到[7]。实验结果也显示耐 INH H37Rv 株在 315 位密码子有突变：AGC 突变为 ACC（丝氨酸突变为苏氨酸）。katG 基因的突变，过氧化酶活性下降，异烟肼失去对细菌的杀灭作用。

    我们用利福平和异烟肼两种药物作用 H37Rv 株培养诱导，菌株对两种药物均产生耐药，用基因芯片测序，在 531 位和 315 位碱基均发生突变：TCG 突变为 TTG，AGC 突变为 ACC。这在国内外学者研究中也曾报道：结核分枝杆菌对多种药物耐药。这给临床带来了困难，提示临床选用其他的药物治疗。

    从我们的实验中证明了国内外学者对结核分枝杆菌耐利福平、异烟肼药物产生，rpoB 基因及 katG 基因突变的研究成果。结核分枝杆菌 rpoB 基因及katG 基因的改变因而产生对利福平及异烟肼耐药。

    基因芯片技术在 90 年代首先由美国 Affymetrix 公司的 Fodor 博士提出并开始基因芯片技术的研究，它是目前分子生物学最前沿的方法，是物、微学和生命的交叉综合的高新技术，是近年来起来的进行大规模遗传变态性检测的新方法。基因芯片技术在结核分枝杆菌菌种鉴定中的应用，具有高速高效等优点，能同时分析成千上万个基因，用基因芯片直接测序可在几小时内测得结果。在结核分枝杆菌耐药性研究中用芯片检测结果突变型，测序结果也是突变型，而且病人痰液中存在少量的 DNA 就能够进行结核分枝杆菌分子的突变，不仅可以正确地确定突变位点和突变类型，而且基因芯片技术能将大量探针同时固定在支持物上，可以一次性对样品序列进行检测和分析。所以可以利用芯片测序的技术来检测患者标本中是否存在结核分枝杆菌，更重要的是它的快速、高效、设备简单。既提高了检测的特异性，又能将结核杆菌感染和其他分枝杆菌感染区分。因此，基因芯片技术可作为临床检测结核杆菌感染。何敏等检测 102 例肺结核患者晨痰标本的结果用基因芯片技术检测的阳性率要高于痰涂片法和痰培养法[8]。这一新技术在临床推广应用具有极大价值，芯片技术创始于 20 世纪 90 年代初，是目前分子生物学最前沿的方法[9]。我们利用基因芯片技术对 H37Rv 株用药物作用诱导检测基因突变，还未在临床广泛应用。下一步工作将用此技术应用于临床，为临床诊断治疗提供新的方法。

【】
  〔1〕全国结核病流行病学抽样调查技术指导组, 全国结核病流行病学抽样调查办公室. 2000年全国结核病流行病学抽样调查报告〔J〕. 防痨杂志, 2002, 24:65-108

〔2〕吴雪琼. PCR直接测序法分析结核分枝杆菌KatG基因突变〔J〕. 临床检验杂志, 2000, 18:9-10

〔3〕李燕. 结核杆菌对利福平耐药的分子机理的研究〔J〕. 四川省卫生管理干部学院学报, 2002, 21:1-2

〔4〕Garcia L, Alons Sanz M, Rebollob MJ, et al. Mutations in the rpoB gene of rifampin-resistant Mycobacterium tubercμLosis islotes in Spain and their rapid detection by PCR-enzyme-linked immunosorbent assay〔J〕. J Clin Microbiol, 2001, 39:1813-1818

〔5〕CAI Mer-ying. Mutation of hydrogen hyperoxide-hyperoxide gene encoded by isoniazid-resistant Mycobacetrium tubercμLosis strains〔J〕. Branch of Microbiology, Foreign Medical Science〔国外医学（微生物学分册）〕, 1995, 18(1):47-48(in Chinese)

〔6〕Zhang Y, Heym B, Allen B, et al. The catalase-peroxidase gene and isoniazid resistance of Mycobacterium tubercμLosis 〔J〕. Nature, 1992, 358N. 6387:591-595

〔7〕吴雪琼, 庄玉辉, 张晓刚, 等. 结核分枝杆菌耐异烟肼分子机制的研究〔J〕. 中国防痨杂志, 1998, 20(1):35

〔8〕何敏. 利用基因芯片检测结核分枝杆菌及其利福平耐药性的研究〔J〕. 中华流行病学杂志, 2003, 24:385-388

〔9〕Cheung VG, Morley M, Aguilar F, et al. Making and reading microarrays〔J〕. Nat Genet, 1999, 21(1):15-19