天然脑活素的记忆改善效果及其分子机理研究

                       作者：吴正治 李映红 李明 陈嫚茵 杨敏 

【摘要】  目的：研究中药古方强记汤及天然脑活素对记忆障碍动物模型在记忆改善方面的作用效果；并运用转基因技术进一步验证天然脑活素对学习记忆分子开关 CREB 基因表达的促进作用。方法：将强记汤及天然脑活素分别以 29.3 g/kg和 18.6 g/kg 的量每日经口灌胃给予 SPF 级小鼠，连续 5 d，第 6 天给药 1 h 后制备成记忆障碍模型，第 7 天给药 0.5~1 h 后分 别用跳台法和避暗法测试记忆成绩；另用不同剂量（50 g/mL 和 150 g/mL）天然脑活素水煎液处理大鼠大脑 B104 CNS 神经细胞，以荧光素酶方法检测 CREB 表达水平。结果：强记汤及天然脑活素水煎液对动物记忆障碍模型小鼠记忆成绩中的潜伏时间、错误次数与模型对照组比较均有统计学意义（P < 0.01）；而且天然脑活素的改善效果明显优于原方（P < 0.01）；不同剂量天然脑活素水煎液 CREB 表达水平与对照组比较有统计学意义（P < 0.01），且有剂量反应关系。结论：中药古方强记汤及天然脑活素对实验动物被动回避反应能力的记忆获得、记忆保持及记忆再现均有的改善作用， 能显著增加在 B104 CNS 神经元细胞中 CREB 基因的表达。

【关键词】  天然脑活素；记忆障碍；记忆成绩；CREB；基因表达

    〔Abstract〕 Objective  To  explore  the  effects  of  traditional  Chinese  medicine  ancient  compound  prescription  Memory-Enhancing  Decoction  (MED)  and  optimized  MED  on  memory  improvement  of  dysmnesia  animal,  and  verify the  promotion  of  optimized  MED  on  the  expression  of  learning  and  memory  molecular  switch  CREB  gene.   Methods  The  SPF  mice  were  treated  with  MED  or  optimized  MED  in  dose  of  29.3  g/kg  and  18.6  g/kg  per day  respectively  by  intragastric  administration  for  five  days  continuously.  And  then,  the  various  dysmnesia  mouse  models  were  prepared  respectively  with  Scopolamine  (3  mg/kg),  Cycloheximide  (120  mg/kg)  by  intraperitoneal  injection  and  40%  alcohol  (0.1  mL/10  g  body  weight)  by  intrag astric  administration  on  the  sixth  day.  Next  day,  memory  result  was  estimated  by  using  Step-down  Test  and  Dark-avoiding  Test  after  the  mice  were  administered  for  half  or  an  hour.  In  addition,  rat  cerebrum  central  nervous  system  (CNS)  nerves  cell  line  B104  cells  were  incubated  with  optimized  MED  in  different  dose  of  50   g/mL  and  150   g/mL  for  a  certain  time.  Then,  we  determined  the  expression  of  CREB  gene  by  means  of  luciferase  enzyme  method.    Results     Both  of  MED  and  optimized  MED  improved  the  memory  results  about  latent  time  and  error  frequency  of  dysmnesia  mouse    models  significantly  comparing  with  model  control  group  (P  <  0.01),  and  the  improvement  of  optimized  MED  was  more  noticeable  than  that  of  MED  (P  <  0.01).  Comparing  with  control  group,  optimized  MED  up-regulated  the  expression  of  CREB  gene  significantly  (P  <  0.01),  and  the  effect  had  a  dose  response  relationship.   Conclusion     Traditional  Chinese  medicine  ancient  compound  prescription  MED  and  optimized  MED  could  improve  the  memory  acquirement,  retention  and  reappearance  of  passive  avoidance  response  ability,  and  increase  the  expression  of  CREB  gene  in  CNS  nerves  cell  B104  cells  notably.

    〔Key  Words〕    Optimized  Memory-Enhancing  Decoction;  Dysmnesia;  Memory  result;  CREB;  Gene  expression

     学习记忆和认知障碍已成为生命和神经科学研究的前沿热点之一[1，2]，尤其是在是神经病学、神经生物学等相关领域的研究中成为最为活跃的方向之一[1-5]。本研究以小鼠为实验对象，用现代行为科学和分子生物学方法观察了经多年筛选的天然脑活素对动物记忆获得障碍、记忆巩固障碍和记忆再现障碍模型记忆功能改善的影响，以期探讨天然脑活素对改善认知障碍特别是在对学习记忆过程不同阶段、不同环节的作用效果及其基因分子作用靶点和机理。

    1    材料与方法

    1.1    材料

    1.1.1    受试样品

    天然脑活素是结合临床经验和现代药效学正交实验优化筛选形成，研究用药由深圳市中西医结合研究所进行生药鉴定并制备成 150% 的水煎浓缩液（每 100 mL 水中含中药生药 150 g），离心过滤，封装消毒，冰箱储藏备用。

    1.1.2    实验动物、细胞株及质粒

    昆明种小鼠 120 只，雄性，3 月龄，由广东省医学实验动物中心提供，合格证 2006A018 号；实验所用大鼠大脑 B104CNS 神经细胞株及 CREB 基因载体质粒由深圳市中西医结合研究所提供。

    1.1.3    主要仪器

    YLS-3T 型小鼠跳台实验自动记录仪；SBA-2 小鼠避暗程序自动控动制仪；PA-4000 型 Four Parameter PulseAgile TM 电穿孔系统为美国 Cyto Pulse Sciences 公司产品。

    1.2    实验方法

    1.2.1    受试物给予的方法和途径

    天然脑活素组以 18.6 g/kg（给药浓度相当于成年人的等效剂量）灌胃给药，取 150% 的水煎浓缩液0.25 mL 加双蒸水至 0.5 mL 即得工作液。各实验组小鼠每天按 0.5 mL/只的体积灌胃给药，观察组给予天然脑活素工作液，对照组给予等体积蒸馏水。

    1.2.2    学习记忆行为学动物试验

    动物在实验室条件下饲养 3 d 后开始实验分组观察。实验分记忆获得、记忆巩固和记忆再现三批，每批实验均用动物 30 只，将小鼠随机分为正常对照组、模型对照组、天然脑活素组 3 组，每组 10 只，按照以上方法灌胃，每日 1 次，连续 7 d。

    1.2.2.1    记忆获得障碍模型制备[3，4]    实验动物连续给予受试物 5 d，第 6 天给受试物 l h 后，模型对照组、天然脑活素组均用东莨菪碱（Scopolamine 3 mg/kg）进行腹腔注射，l0 min 后开始跳台法训练，记录学习成绩。第 7 天给受试物 l h 后，再用跳台法测试记忆成绩。

    1.2.2.2    记忆巩固障碍模型制备[3，4]    实验动物连续给予受试物 5 d，第 6 天给药 l h 后进行跳台训练，记录训练成绩，然后对模型对照组、天然脑活素组立即腹腔注射环己酰亚胺（Cycloheximide）120 mg/kg，第 7 天给受试物 l h 后，测试记忆成绩。

    1.2.2.3    记忆再现障碍模型制备[3，4]    实验动物连续给予受试物第 6 天给药 l h 后进行避暗法训练，记录训练成绩，第 7 天给受试物 30 min 后模型对照组、天然脑活素组均用 40% 乙醇 0.1 mL/10 g 体重的量灌胃，30 min 后测试记忆成绩。

    1.2.2.4    跳台试验（Step-down test）[3]    首先将小鼠置于跳台仪中，适应环境 5 min 后，轻放于平台上，当动物从跳台上跳下四肢接触铜栅时，即给予 40 V 交流电压刺激。记录小鼠逃避至平台上的潜伏期（Ecape Latency, EL），并记录 5 min 内的触电次数（错误次数），以此做为学习成绩。24 h 后进行记忆成绩的测试。将小鼠置平台上，记录其停留在安全平台上的潜伏期（Step-down Latency）及其 3 min 内受电击的次数（错误次数），若小鼠停留在平台上超过 3 min，其潜伏期以 180 s 计。

    1.2.2.5    避暗试验[4，6]    实验时将小鼠面部背向洞口放入明室，同时启动记时器。动物穿过洞口进入暗室受到电击，记时自动停止。取出小鼠，记录小鼠从放入明室进入暗室遇到电击所需的时间，此即为潜伏期。24 h 后重新测验，记录进入暗室的动物数，潜伏期和 5 min 内被电击次数（错误次数）。5 min 内未进入暗室者，潜伏期以 300 s 计。

    1.2.3    CREB 基因转染实验

    1.2.3.1    细胞培养    B104 CNS 神经细胞株细胞培养于加有 5% 胎牛血清（fetal bovine serum, FBS）和常规抗生素的 Dulbecco’s Modified Eagle Medium（DMEM）中。培养细胞在含空气 95%，CO2 5%，潮湿，气温 37℃的条件下，盛于塑料培养瓶中孵育。培养介质每 48 h 更换 1 次。

    1.2.3.2    CREB 基因转染[7]    CREB 基因载体质粒由深圳市中西医结合研究所分子生物学实验室提供。运用 Four Parameter PulseAgile TM 电穿孔系统（PA-4000, Cyto Pulse Sciences, Inc.），将 pCRE DNA 转染大鼠 CNS 神经元细胞株 B104。主要方法：胰酶消化法收集 B104 细胞，将细胞以 1×106 个细胞/mL 的浓度重新悬浮在不含血清的 DMEM中。将 700   L 细胞悬液加入 4 mm gap-电穿孔管中，加入 pCRE DNA。电穿孔前，将小管置于室温下。细胞在 750 V，0.2 mms，间隔 0.5 和脉冲 5 的条件下进行电穿孔转染基因。

    1.2.3.3    药物干预    转染细胞在含 5% FBS 的DMEM 中按 4×105 细胞/孔的浓度加入到 6 孔培养板上。使细胞贴壁 4 h 后，用天然脑活素处理 5 d（天然脑活素按 0，50，150   g/mL 的浓度加入各孔）。每隔 48 h 更换培养基和天然脑活素 1 次，观察处理细胞 5 d。

    1.2.3.4    基因表达定量检测    在用天然脑活素处理细胞 5 d 后，用荧光素酶方法检测 CREB 表达水平。观察结束后，用 D-PBS（Dulbecco’s 磷酸盐缓冲液）冲洗细胞。然后在 6 孔培养板的每孔中加入100   L 细胞裂解缓冲液（细胞破碎剂）。收集细胞消化液，低温高速离心，上清留作荧光素酶检测用。用荧光检测仪自动测定荧光素酶活性 10 s，记录。荧光素酶活性以相对亮度单位（RLU）表示[7]。

    1.2.4    数据处理

    所有数据都以 x±s（均数±标准差）表示。多个实验组之间的统计学显著性用 Student-Newman-Keuls 单因素方差分析进行两两比较。显著性水平设定为 P < 0.05。

    2    实验结果

    2.1    天然脑活素对记忆障碍模型小鼠的影响

    2.1.1    天然脑活素对小鼠跳台试验潜伏时间、错误次数的影响

    由表 1、表 2 结果可见，不论是记忆获得障碍模型实验还是记忆巩固障碍模型实验，在训练测试时，正常对照组、受试物实验组的动物错误次数均低于病理模型对照组，与模型对照组比较，差异有统计学的显著性意义（P < 0.05-0.01）；正常对照组、受试物实验组潜伏期延长，与模型对照组比较，差异有统计学的显著性意义（P < 0.05）。结果表明，天然脑活素对记忆的获得和巩固过程有显著促进作用。

    2.1.2    天然脑活素对小鼠避暗试验潜伏时间、错误次数的影响

    由表 3 结果可见，在学习记忆行为训练测验中，正常对照组、受试物实验组的错误次数减少，潜伏期延长，与模型对照组比较，差异有统计学的显著性意义（P < 0.01），天然脑活素实验组的错误次数与强记汤试验组比较，差异也有统计学意义（P < 0.05）在小鼠避暗实验中，强记汤和天然脑活素对记忆的再现过程有明显促进作用。

    2.2    天然脑活素对 B104 神经元 CREB 基因表达的影响

    由表 4 可见，各剂量组的天然脑活素均能显著促进 CREB 的表达，与对照组比较，差异有统计学意义（P < 0.01）；并呈现明显的剂量效应相关性，高剂量天然脑活素处理组比低剂量天然脑活素处理组 CREB 的表达显著增高（P < 0.05）。结果表明天然脑活素能激活 CREB 细胞信号通路，促进 CREB 在 B104 CNS 神经元细胞中的表达。

    3    讨    论

    学习记忆是当代神经研究的重要热点领域。记忆可分为获得、巩固和再现三个阶段[4，6]，记忆障碍模型是评价药物对记忆过程影响的有效手段[4，6]。跳台法可以考察受试物对记忆全过程的影响，而避暗法是考察受试物对记忆再现障碍的敏感方法[4]。

    对记忆的研究一直是神经生物学家和生理心家关注的热点，对记忆形成过程的不同阶段所发生的生理生化变化及神经元形态改变的研究使人们对记忆的过程有了愈来愈清晰的认识。自从 Bliss 发现兔的海马神经元在高频刺激后产生“突触”长时程增强（Long Term Potentiation, LTP）效应后，研究者们对 LTP 的特征、形成机理以及与动物行为的相关性研究已积累了丰富的资料，为 80 年代以来神经科学领域中最富有成果的研究领域之一，目前认为，LTP 现象是目前研究学习和记忆细胞机制的理想模型[8-10]。

    东莨菪碱是 M-胆碱能受体阻断药，它的药理作用已研究的很清楚，能造成记忆获得障碍；环己酰亚胺是蛋白质合成抑制剂，蛋白质合成是记忆形成和巩固的基础，环己酰亚胺抑制蛋白质合成造成记忆巩固障碍，而乙醇从影响脑内蛋白质、RNA、胆碱能及多巴胺等多个方面造成记忆的再现障碍。从动物实验的结果发现，天然脑活素能显著改善这三方面的记忆障碍，提示天然脑活素的改善记忆功能的作用可能与影响胆碱能系统、促进神经系统蛋白质合成、影响脑内蛋白质、RNA、胆碱能及多巴胺合成分泌等有关。

    近年的许多研究显示，“突触”增强效应是形成大脑记忆的基础，而环磷酸腺苷反应单元结合蛋白（CREB）的磷酸化在“突触”可塑性和长期记忆中发挥关键作用[1，2，10]。美国冷泉港实验室（Cold Spring Harbor Laboratory）的 Tim Tully 是国际赫赫有名的脑研究科学家。Tim Tully 研究发现 CREB 基因不仅能让果蝇恢复正常的记忆，外源性的 CREB 也能让果蝇拥有照相一般的记忆力；如果 CREB 基因关闭或发生突变，则果蝇不论接受多少次训练，都无法取得记忆[11]。CREB 与脊椎动物和无脊椎动物的长时程可塑性都有关系。在α/βCREB 缺乏时，长期记忆能力降低，并且海马 LTP 的长期维持能力降低[11]。B104 是来源于大鼠 CNS 神经细胞瘤的细胞株，已被作为 CNS 神经元细胞株而广泛应用[12]。CREB 基因是目前国际上公认的学习记忆生理过程关键的调节基因，被称为脊椎动物学习记忆的分子开关。只有该基因有表达时，学习记忆过程和记忆痕迹才能形成。我们的研究表明，天然脑活素能显著促进 CREB 在 B104 CNS 神经元细胞中的表达，其药效学作用呈现出明显的量效依赖关系。

    综上，天然脑活素对记忆获得、巩固和再现各个阶段均有明显的影响，激活 CREB 可能是天然脑活素在体内改善学习和记忆的的重要作用基因靶点，其益智作用的机理涉及到多个系统和环节，值得进一步深入研究，同时也显示天然脑活素作为一种新型益智键脑、促进和增强学习记忆能力的纯天然中药具有重要的开发价值和广阔的市场前景。

【】
  〔1〕 Sun CY, Qi SS, Lou XF, et al. Changes of learning, memory and levels of CaMKII, CaM mRNA, CREB mRNA in the hippocampus of chronic multiple-stressed rats〔J〕. Chinese Medical Journal, 2006, 119(2):140-147

〔2〕 Rudy JW and Wright-Hardesty K. The temporal dynamics of retention of a context memory:Something is missing〔J〕. Learning & Memory, 2005, 10(12):172-177

〔3〕 张均田, 斋藤洋. 12种化学药品破坏小鼠被动回避性行为——跳台法与避暗法实验的比较观察〔J〕. 药学学报, 1986, 21:12

〔4〕 张磊, 张均田. 学习记忆的实验方法和记忆障碍模型〔J〕. 药学通报, 1988, 23:475

〔5〕 朱晓东, 唐烯灿. 石杉碱甲和乙对小鼠记忆损伤的改善作用〔J〕. 药理学报, 1988, 9:492

〔6〕 裘月, 杜冠华, 屈志炜, 等.小鼠暂时性脑缺血引起学习记忆障碍模型的制备及人参皂甙的保护作用〔J〕. 中国药理学通报, 1995, ll:299

〔7〕Huang CJ, Spinella F, Nazarian R, et al. Expression of Green Fluorescent Protein in Oligodendrocytes in a Time-and Level-Controllable Fashion with a Tetracycline-Regulated System〔J〕. Molecular Medicine, 1999, 5:129-137

〔8〕 刘燕强, 欧景范. 学习记忆的神经生化学机制研究概况〔J〕. 生理科学进展, 1998, 29:203

〔9〕 管强, 曹学兵, 徐岩, 等. 反义FosB和反义CREB基因抑制左旋多巴诱发异动症大鼠前强啡肽原基因的表达〔J〕. 中华神经科杂志, 2006, 39(1):48-51

〔10〕Pittenger C, Kandel E. A genetic switch for long-term memory〔J〕. C R Acad Sci III, 1998, 321(2-3):91-96

〔11〕Tim Tully. Regulation of gene expression and its rolein long-term memory and synaptic plasticity〔J〕. ProcNatl Sci USA, 1997, 94:4239-4241

〔12〕Segal M, Murphy DD. CREB activation mediates plasticity in cultured hippocampal neurons〔J〕. Neural Plast, 1998; 6(3): 1-7