多重 PCR 检测耐万古霉素肠球菌的基因型研究

【摘要】  目的：研究 7 株耐万古霉素肠球菌（VRE）耐药表型和基因型，指导临床合理使用抗生素。方法：采用琼脂筛选法筛选 VRE，并分别用 E test 、多重 PCR 和限制性长度多态性分析方法检测万古霉素耐药或中介肠球菌株的表型和基因型。结果：7 株对万古霉素耐药或中介的肠球菌株，2 株为 van A 型，3 株为 van C1 型，1 株为 van C 2/3 型，1 株基因型未明，基因型和表型一致。结论：7 株 VRE 中有 2 株 van A 型，提示实验室准确检测 VRE 对临床上合理使用抗生素和 预防 VRE 的流行是非常重要的。

【关键词】  万古霉素；耐药性；肠球菌；表型；基因型

    〔Abstract〕Objective     Vancomycin  resistance  phenotypes  and  genotypes  were  studied  for  know  the  distribution  of  7  vancomycin  resistant  enterococci  (VRE)  in  Shenzhen  Second  People's  Hospital  and  instruct  rational  application  of  antibiotics  clinically.    Methods     Screening  VRE  with  agar  screen,  and  detecting  the  phenotypes  and  genotypes  of  vancomycin  resistant  or  intermediate  enterococci  with  E  test  and  multiplex   PCR-restriction  fragment  length  polymorphism.    Results  7  strains  were  vancomycin-resistant  or  intermediate   to  enterococci,  vanA  for  2  strains  were  detected,  vanC1  for  3  strains  were  detected,  vanC2/3  for  1   strain  was  detected,  1  strain  was  unknown.  Their  phenotypes  confirmed  to  the  genotypes.    Conclusion  2  strains  vanA  have  found.  It  is  important  for  clinical  laboratory  to  detect  VRE  with  right  methods  to  instruct rational  application  of  antibiotics  clinically  and  prevent  VRE  prevalence.

    〔Key  Words〕    Vancomycin;  Resistance;  Enterococcus;  Phenotypes;  Genotypes

    近年来万古霉素耐药肠球菌（Vancomycin-resistant enterococci, VRE）感染不断上升，美国 2004 年对 670 家的耐药监测显示 VRE 位于医院耐药菌第 2 位[1]。其耐药机制为细菌细胞壁结构改变，万古霉素与之亲合力下降，基因分型至少有vanA、vanB、vanC、vanD 和 vanE 等型别。肠球菌可引起菌血症、心内膜炎以及泌尿系、腹腔和伤口感染。本实验采用多重 PCR 技术对肠球菌耐万古霉素基因进行了检测，以满足临床快速、特异的检测耐万古霉素基因分布及流行病学研究。

    1    材料和方法

    1.1    菌株来源    标准菌株：ATCC29212（粪肠球菌）；菌株：vanA、vanB、vanC1 和 vanC2 等 4 株 VRE 菌株均由上海第二医科大学附属瑞金医院惠赠。

    1.2    抗生素纸片    万古霉素、替考拉宁药敏纸片和 Etest 试纸条分别购自 Oxoid 和 AB Biodisk 公司。

    1.3    主要试剂    GPI 鉴定卡购自生物梅里埃公司；M-H 琼脂、脑心浸液培养基购自 Oxoid 公司；Taq 酶及 dNTPs 等购自上海英俊公司；引物：van A，van B，van C1 和 van C23 由上英俊公司合成。引物序列 vanA：P1:5，-CATGACATATCGGTAAAATC-3，P2:5，-CATGACATATCGGTAAAATC-3，（885bp）；vanB：P1:5，-CATGATGTGTCGGTAAAATC -3，P2:5，-ACCGGGCAGRGTATTGAC-3，（885bp）；vanC1：P1:5，-GATGGCAGTATCCAAGGA -3，P2：5，-GTGATCGTGGCGCTG-3，（467bp）；vanC2/C3：P1:5，-GATGGCAGTATCCAAGGA-3，P2:5，-ATCGAAAAAGCCGTCTAC-3，（429bp）[2]。

    1.4    主要实验仪器    VITEK-32 AMS 微生物鉴定系统，生物梅里埃公司；DNA 扩增仪，MJ公司；GeneGENIUS 全自动凝胶图像分析系统，SYNGENE 公司。

    1.5    菌株鉴定    用 VITEK-32 AMS 微生物鉴定系统和 GPI 鉴定卡鉴定肠球菌。

    1.6    药敏试验（纸片扩散法和 E test）    按美国临床实验室标准化委员会 2004 年版操作和判断结果。

    1.7    细菌 DNA 提取    将细菌接种在普通营养琼脂（LB）液体培养基中，35℃过夜。取 1.5 mL 菌液倒入 eppendorf 管中，12 000 r/min 离心 5 min，去上清，用 80   L DNA 提取液将细菌重悬，混匀，100℃水浴 20 min 后，取出并迅速置于冰上，放置 10 min，10 000 rpm/min 离心 1 min，上清即为模板。

    1.8    多重聚合酶链反应（PCR）    反应体积 50   L，含引物混合液 8   L〔取 vanA-FOR（10 pmol/  L），vanB-FOR（10 pmol/  L），vanC1-REV（10 pmol/   L），vanC23-REV（10 pmol/   L）各 20   L；vanAB-REV（10 pmol/   L），vanC123-FOR（10 pmol/   L）各 40   L 于 1.5 mL 离心管中充分混合〕，dNTPs 2   L，模板 3   L，Taq 酶 1.25 U。PCR 反应条件：94℃预变性 5 min，94℃ 45 s ，50℃ 45 s，72℃ 2 min 共 30 个循环，最后 1 个循环后 72℃延伸 7 min，扩增产物加入 1% 的琼脂糖凝胶，电泳后在全自动凝胶图像分析系统下照相观察。

    1.9    限制性内切酶酶切    对阳性片段用 Msp I 酶切鉴定分型，酶切体系 20   L，其中 2   L 内切酶缓冲液、2   L BSA、1   L Msp I、5   L 无菌水和 10   L PCR 产物，将样本置于37℃水浴中酶切 1 h。产物加入 3% 的琼脂糖凝胶，电泳后在全自动凝胶图像分析系统下照相观察。

    2    结    果

    2.1    肠球菌耐万古霉素琼脂筛选结果    7 株VRE 均在含 6   L/mL 万古霉素的 BHI 筛选平板上生长，其中 1 株为粪肠球菌，2 株为屎肠球菌，3 株为鹑鸡肠球菌，1 株为铅黄肠球菌。

    2.2    E test 结果    对 3 株筛选出的肠球菌和 4 株天然耐药肠球菌（3 株鹑鸡肠球菌和 1 株铅黄肠球菌），用 E test 测定其对万古霉素和替考拉宁的最小抑菌浓度（MIC），见表 1。

    2.3    基因检测结果    7 株 VRE 用多重 PCR 和限制性内切酶酶切方法进行耐药基因检测，结果 2 株为 van A 型，3 株为 van C1 型，1 株为van C2/3型，1 株基因型未明。

    3    讨    论

    自 1986 年美国报告耐万古霉素肠球菌以来，世界各国相继报告 VRE 发生与流行情况，到 2001 年美国 VRE 发生率达 15% 左右，为全球之冠，其他国家 VRE 在 5% 左右[3]。肠球菌耐糖肽类药物机制主要在于细菌细胞壁肽聚糖前体 5 肽侧链末端 D - 丙氨酸 - D - 丙氨酸发生改变，药物与之亲和力降低，细胞壁合成不再被抑制而耐药，迄今发现的耐药基因型主要有 vanA、vanB、vanC、vanD 和vanE，目前研究最多的主要是 vanA、vanB、vanC 基因型，其中 vanA 对万古霉素和替考拉宁均呈高水平耐药，vanB 对万古霉素呈不同水平耐药，对替考拉宁敏感，该两型为获得性耐药，而 vanC 为天然耐药，但其耐药水平低，且大多发生于非致病肠球菌（如鹑鸡肠球菌、铅黄肠球菌），临床价值有限[4]。本次实验筛选出 7 株耐万古霉素肠球菌，其中1株粪肠球菌基因型不明，2 株屎肠球菌，表型及基因型均证实为 vanA 型，3 株天然耐药型鹑鸡肠球菌和 1 株铅黄肠球菌，基因型为别为 vanC1 和 vanC2/3，与表型一致。可见针对 VRE 应保持高度警惕，规范临床抗生素合理使用，开展耐药监测与耐药机制研究，有利于避免 VRE 流行和播散。

    目前耐万古霉素肠球菌实验室检测主要有药敏纸片法、琼脂筛选法、自动仪器法和分子生物学等方法。不同方法检测结果有时存在较大差异。据报道，药敏纸片法在检测 vanC 型肠球菌时容易漏检，而琼脂筛选法和分子生物学方法检测 VRE 菌株敏感率较高[5]。本实验显示1株鹑鸡肠球菌，多重PCR 检测结果是 vanC1 型，但药敏纸片法为阴性。多重 PCR 检测发现 1 株基因型不明菌株，有待进一步研究。

【文献】
  〔1〕Diekema DJ, BootsMiller BJ, Vaughn TE, et al. Antimicrobial resistance trends and outbreak frequency in United States hospitals〔J〕. Clin Infect Dis, 2004, 38(1):78-85

〔2〕Patel R, Uhl JR, Kohner P, et al. Multiplex PCR detection of vanA, vanB, vanC-1, and vanC-2/3 genes in enterococci〔J〕. J Clin Microbiol, 1997, 35(3):703-707

〔3〕Pootoolal J, Neu J, Wright GD. Glycopeptide antibiotic resistance 〔J〕. Ann Rev Pharmacol Toxiol, 2002, 42(4):381-408

〔4〕Arthur M, Quintiliani R JR. Regulation of vanA-and vanB-type glycopeptide resistance in enterococci〔J〕. Antimicrob Agent Chemother, 2001, 45(2):375-381

〔5〕Hubert PE. Comparison of eight methods to detect vancomycin resistance in enterococci〔J〕. J Clin Microbiol, 1998, 36(2): 592-594