清肺化痰汤合红霉素对 COPD 痰热阻肺证大鼠模型的疗效及机理探讨

                            作者：黄美杏 龚享文 陈斯宁 姚玉兰 张华玲

【摘要】  目的：探讨清肺化痰汤合红霉素对慢性阻塞性肺疾病（COPD）大鼠血清、肺泡灌洗液（BALF）中白介素-8（IL-8）表达及气道炎症的影响。方法：将 40 只 SPF 级 Wistar 大鼠随机分为 4 组，采用复合因素造模法建立COPD 大鼠模型，以观察清肺化痰汤合红霉素对 COPD 大鼠血清、BALF 中 IL-8 表达及气道炎症的影响。结果：与空白组比较，模型组各大鼠小气道出现组织细胞损伤、管壁炎症细胞浸润、血管增生及肺泡的融合，血清及 BALF 的 IL-8 的含量明显上升；与模型组比较，红霉素组在应用红霉素干预后大鼠小气道出现组织细胞损伤、管壁炎症细胞浸润、血管增生及肺泡的融合有所好转，血清及 BALF 的 IL-8 的含量明显下降，具有统计学意义；红霉素+清肺化痰汤组较红霉素组在同样的检测指标有明显下降。结论：清肺化痰汤合红霉素可以降低血及 BALF 中 IL-8 的表达，明显的抑制气道炎症的改变，提示清肺化痰汤具有 COPD 气道炎症的作用。

【关键词】  清肺化痰汤；COPD；IL-8；气道炎症

    〔Abstract〕    Objective     To  discuss  the  effects  of  Qingfei  Huatan  decoction  combined  with  erythromycinin  COPD  (chronic  obstructive  pulmonary  disease)  model  rats,  including  IL-8  in  serum、BALF  and  airway inflammation.    Methods     40  SPF  level  Wistar  rats  were  randomly  divided  into  4  groups,  COPD  model rats  were  induced  by  complex  factors,  which  is  in  order  to  observe  the  effects  of  Qingfei  Huatan  decoction combined  with  erythromycin  on  the  expression  of  IL-8  in  serum、BALF  and  airway  inflammation.    Results     Compared  with  control  group,  model  group  appeared  cell  injury  in  small  airway,  inflammatory  wall cells  infiltration,  angiogenesis  and  integration  of  alveoli,  IL-8  levels  in  serum  and  BALF  increased  significantly; compared  with  those  of  model  group,  after  the  intervention,  small  airway  tissue  injury,  wall  infiltration  of inflammatory  cells,  angiogenesis  and  integration  of  alveoli  were  all  improved,  IL-8  levels  in  serum  and  BALF decreased  significantly  in  erythromycin  group;  compared  with  those  of  erythromycin  group,  indices  of  erythromycin +  Qingfei  Huatan  decoction  group  were  decreased  significantly.     Conclusion     Qingfei  Huatan  decoction combined  erythromycin  can  reduce  the  expression  of  IL-8  in  serum  and  BALF,  significantly  inhibit  the  change  of  airway  inflammation,  suggesting  Qingfei  Huatan  decoction  can  treat  COPD  airway  inflammation.

    〔Key  Words〕    Qingfei  Huatan  decoction;  COPD;  IL-18;  Airway  inflammation

    1    材料与方法

    1.1    实验材料与仪器　

    健康雄性 SPF 级 Wistar 大鼠，体重为（250±20）g，广西医科大学动物实验中心提供；LPS（脂多糖）购自美国 Sigma 公司，用蒸馏水配成浓度为 200   g / 200   L 溶液。香烟：刘三姐烤烟型香烟，南宁卷烟厂生产，焦油含量为 15 mg，烟碱含量为 1.1  mg；自制 0.5 m×0.55 m×1.5 m 的玻璃箱，一次性中心静脉穿刺引流管（驼人牌）购自河南驼人医疗器械公司，IL-8 放免试剂盒购自解放军总科技开发中心，BALF TNF -α ELISA 试剂盒购自尚柏生物医学技术有限公司，严格按照说明书操作；检测仪器：SN-695B 型智能放免γ测量仪，酶标仪电脑分析系统 ELX808（美国产）。

    1.2    试验用药

    清肺化痰汤：桑白皮、黄芩、鱼腥草、瓜蒌壳、瓜蒌仁、川贝、苏子、茯苓、半夏、杏仁、甘草，上述免煎中药均购自江阴天江药业有限公司，灌胃用，每天 1 次，共 14 d。

    红霉素：注射用乳糖酸红霉素 30 万 U，大连美罗大药厂生产（国药准字 H21021227）。

    1.3    实验方法

    1.3.1    动物分组

    SPF 级健康雄性 Wistar 大鼠 40 只（鼠龄 12 周），按随机数字表分为 4 组，每组 10 例，第 1 组作为空白组，第 2 组为模型组，第 3 组为红霉素组，第 4 组为红霉素+清肺化痰汤组（红+清组）。4 组大鼠均以相同的饲料及水喂养。

    1.3.2    造模方法

    采用复制林芫等建立 COPD 大鼠模型的方法[1]，运用烟雾吸入、LPS 灌肺、冷空气刺激复合因素大鼠 COPD 造模方法。在造模的第 1 天、第 14 天在大鼠麻醉后，于胸骨上 1 cm 处进行气管切开，向大鼠气管内注入 LPS 100 U（1 mg/mL），第 2~13 天、15~25 天，每天在有机玻璃密闭箱持续吸入新鲜的香烟雾 2 h，20 支/d，每天熏烟后立刻用低于环境温度（20℃）5℃冷空气刺激 1 h，造模 28 d 结束。

    痰热阻肺证模型的建立[2]：26 d 气管加滴 LPS 1 次。

    1.3.3    治疗方法

    空白对照组及模型组模型建立后灌胃相同剂量的生理盐水。红霉素组在模型确立后应用红霉素腹腔注射治疗，根据体表面积换算方法（具体用药药量为 10 mg/kg2，第 4 组为红霉素+清肺化痰汤组，在灌服红霉素的基础上加用清肺化痰汤清肺化痰汤用药剂量 1995 年版《药典》，用药量相当于临床等效剂量（根据人和动物按表面积折算的等效剂量比率表），具体用药量为 0.768 g/kg，每天 1 次，共 14 d。

    1.4    观测指标及方法

    1.4.1    大鼠症状行为学

    大鼠精神状态、活动性、黏膜颜色，皮毛颜色，食欲状况、体重变化、咳嗽、气喘、喉中痰鸣、肺部触及语颤、呼吸费力等。

    1.4.2    病理解剖学

    1.4.2.1    大鼠气管、支气管、肺组织病理标本制备    动物处死后，迅速摘取大鼠的肺组织，右下肺、部分气管支气管经 10% 甲醛溶液固定。肺大体观察，右肺上叶组织 HE 染色行光镜观察，光镜下观察大鼠的小气道炎症、气道重塑、肺泡改变、血管炎症、血管平滑肌增殖情况、炎症细胞浸润的情况。

    1.4.2.2    小气道炎症改变    根据 Cosio 等设计的小气道病变评估方法和标准观察小气道炎症及重构情况。气道病理改变评分表评价指标共 10 项，每项分为 0~3 级。分别积以 0~3 分，其中气道纤毛倒伏粘连缺失、上皮细胞变性坏死糜烂脱落、气道上皮杯状细胞增生、气道上皮鳞状化生、气管壁黏膜充血水肿、气道平滑肌细胞断裂/增生 6 项的病变程度分别为无、< 1/4 周径、1/4~1/2 周径、> 1/2 周径；气道管壁单核巨噬细胞浸润、气道管壁中性粒细胞浸润、气道管壁嗜酸细胞浸润 3 项分别为无、< 10 个/HP、10~20 个/HP、> 20 个/HP；气道管壁淋巴细胞浸润分别为无、未形成滤泡、有滤泡、滤泡明显。

    1.4.3    细胞因子标本收集及检测

    1.4.3.1    血清因子的收集与检测    用 10% 乌拉坦注射液（1 mL/100 g）腹腔麻醉动物，仰卧位固定，破开腹腔，从腹主动脉中取血 3 mL，放入离心管内，3 000 r/min 离心 20 min，收集上清液，保存在 - 20℃低温冰箱统一备测，放免法检测血清 IL-8 含量。

    1.4.3.2    BALF 的收集与检测    切开胸腔，钝性分离气管和食道，结扎右主支气管，在主支气管处剪一小口，用一次性中心静脉穿刺管，进入 0.5~1 cm 结扎固定，行左侧支气管肺泡灌洗，针管分别抽取 3 mL 生理盐水，每次缓慢注入，保留 30 s 后回抽，重复 3 次，每只大鼠收集 BALF 6 mL，2 000 r/min 离心 10 min，用酶联免疫法检测 BALF 中 IL-8 的含量。

    1.5    统计学方法

    用 SPSS 13.0 统计软件进行统计学处理，计量资料以 x±s 表示，组间比较用单因素方差分析。

    2    结    果

    2.1    症状行为学结果

    空白组大鼠精神状态好，活动能力强，营养良好，被毛白皙有光泽，饮食正常，体重增长迅速，呼吸平稳，无喉中痰鸣、肺部未触及呼吸震颤、咳嗽、气促、口唇紫绀等现象，模型组大鼠精神差、活动性差、被毛灰黄，脱落稀疏，饮食明显减少，体重增长明显减慢，呼吸喘促，肺部触及呼吸震颤、咳嗽、气促、口唇紫绀等现象。红霉素组精神稍差，活动能力下降，大鼠毛发欠润泽，有被毛脱落，饮食较少，体重增长减慢，呼吸喘促，肺部无触及呼吸震颤、无呼吸费力、但有咳嗽、气促、口唇紫绀等症状。红+清组大鼠精神欠佳，活动能力稍下降，毛发欠润泽，无毛发脱落，饮食较多，体重增长明显，无呼吸喘促，肺部无触及呼吸震颤、但仍有咳嗽、气促、口唇紫绀等症状。

    2.2    病理解剖学

    空白组见气管黏膜纤毛柱状上皮细胞完整，纤毛整齐，气管及各级支气管仅见散在的杯状细胞，未见腺体增生及明显炎症细胞浸润，气道结构未见异常；肺泡大小正常，结构完整，未见炎症细胞浸润；肺血管平滑肌均匀，无增生，周围无炎症细胞浸润（见图 1）。模型组见支气管黏膜上皮纤毛倒伏，上皮部分脱落，部分支气管腔内可见炎性分泌物，杯状细胞增生，较多慢性炎症细胞浸润，肌层断裂，部分腺泡萎缩、破坏，管腔狭窄，肺泡破裂并融合在一起，肺小血管变形并有血管平滑肌增生，管腔狭窄及炎症细胞浸润（见图 2）。红霉素组见支气管黏膜上皮纤毛倒伏，上皮部分脱落，部分支气管腔内可见炎性分泌物，杯状细胞增生，有慢性炎症细胞浸润，肌层断裂，部分腺泡萎缩、破坏，管腔狭窄，肺泡破裂并融合在一起，并见肺泡周围中性粒细胞浸润，肺小血管可见变形并有血管平滑肌增生，管腔狭窄及炎症细胞浸润等病理改变较模型组有所减轻（见图 3）。红霉素组+清肺化痰汤见脱落的黏膜上皮及杯状细胞增生轻于红霉素组，周围肺泡壁增厚较轻，支气管腔内见少量分泌物。气道、肺泡炎症浸润及气道重塑和肺小血管病变好于红霉素组（见图 4）。

    3    讨    论

    医学认为 COPD 是一种具有气流受限特征的疾病，气流受限不完全可逆，呈进行性，与肺部对有害气体或有害颗粒的异常炎症反应有关。它的发病根本在于各种致病因素作用于机体导致的气道，肺实质和肺血管的慢性炎症，各种炎症细胞通过释放多种生物活性物质而参与慢性炎症的发生。IL-8 是中性粒细胞趋化因子，在 COPD 急性加重期，由于细菌感染，导致患者血清中内毒素水平增高，炎细胞释放细胞因子 IL-1、TNF -α等，在细胞因子的刺激诱导下，单核细胞、中性粒细胞等多种细胞均可产生 IL-8，IL-8 则通过与上述细胞表面 IL-8 受体结合，趋化上述细胞到达炎症部位引起炎症反应[3]。Ziegenhagen 测定患者血和 BALF 中的 IL-8 浓度，发现两者同时升高，且与 BALF 中的中性粒细胞数目呈明显正相关[4]，因此我们可以得知 IL-8 参与了 COPD 的慢性炎症，也一定程度上反映了 COPD 病情的轻重。

    COPD 属于祖国医学中“肺胀”的范畴，因外邪诱导而发导致肺气胀满，不能敛降的一种病症。清肺化痰汤具有清热宣肺，止咳化痰的功效。方中有麻黄宣肺平喘，黄芩、桑白皮以清泄肺热，止咳平喘；杏仁、半夏敛肺祛痰定喘；甘草和调药。中药药理研究显示：麻黄碱（麻黄、半夏）具有促使支气管扩张，并缓解组胺或乙酰胆碱所致的呼吸道痉挛；杏仁甙（杏仁）具有抑制咳嗽中枢而起镇咳平喘的作用；甘草酸具有拮抗组胺、乙酰胆碱的作用。红霉素能够部分减轻模型组全身以及局部气道壁、气管腔内的炎症反应，起抗炎作用[5]。根据我们的实验结果提示：清肺化痰汤合用红霉素可以发挥协同作用，显示说明清肺化痰汤合红霉素较单纯的红霉素能够更好的抑制炎症细胞表达炎症介质 IL-8（与红霉素组比较，P < 0.05）及缓解气道，尤其是小气道的慢性炎症（与模型组比较，P < 0.05），说明清肺化痰汤具有明显的 COPD 的作用。

【】
  〔1〕林芫, 白晶, 钟小宁, 等. 红霉素在慢性阻塞性肺疾病中的作用及其机制〔J〕. 药学杂志, 2008, 43(13):978-981

〔2〕张伟, 李刚, 张心月, 等. 辨证施治对各型慢性阻塞性肺疾病大鼠核因子κ表达和气道病理改变的影响〔J〕. 上海中医药杂志, 2006, 40(8):65-68

〔3〕向成玉, 邓正华, 邓剑. IL-4及IL-8检测在慢性阻塞性肺疾病中的意义〔J〕. 实用预防医学, 2006, 13(1):66-67

〔4〕Ziegenhagen MW, Zebel P, Zissel G, et al. Serum level of inter-leukin8is elevated in idiopathic pulmonary fibrosis and indicatesdisease activity〔J〕. Am J Respir Crit Care Med, 1998, 157(3Pt1):76

〔5〕白晶, 万小华, 梁国容. 红霉素在慢性阻塞性肺疾病气道炎症中的作用〔J〕. 实用中西医结合临床, 2006, 5(6):3-4