生精细胞凋亡的研究
【关键词】 细胞凋亡
1900年，Regand首次认识到精子发生过程中存在着生殖细胞的退化。对大鼠等啮齿目动物的研究表明，生精过程中实际产生的精子数量比理论预测减少25%～75%［1］。20世纪70年代，Kerr等提出细胞凋亡（apoptosis）的概念，包括程序化细胞死亡（programmedcell death,PCD）和非程序化细胞死亡（nonprogrammedcell death,NPCD），提示细胞凋亡在男性生殖中具有重要影响［2］。现已证实，睾丸生殖细胞退化是通过细胞凋亡实现的。在精子发生各个阶段，都存在自发性的生精细胞凋亡。但不同时期凋亡细胞数目有很大差异，原位检测表明，在精子发生过程中主要是精原细胞和精母细胞发生凋亡，而精子细胞凋亡很少发生。精原细胞特别是A精原细胞凋亡是导致精子数少的主要原因，其凋亡均发生在有丝分裂期间。精母细胞凋亡发生在减数分裂过程中的细线前期、偶线期，特别是粗线期。睾丸就是通过精原细胞不断增殖，同时过量的受到损伤的生精细胞不断凋亡，来控制精子细胞数目，维持精子发生的动态平衡。本文就睾丸生殖细胞凋亡的生理意义、机制和影响因素作一综述。
1 生精细胞凋亡及其生理意义
生精过程是指精原细胞经过多次有丝分裂，最后发育成精子，其中存在精细复杂的调节机制。生精细胞凋亡主要发生在三个阶段：首先是在A型精原细胞的有丝分裂；其次是精母细胞的减数分裂；最后是精子发生的过程［3］。生精细胞的凋亡还与生精上皮处于生精周期阶段有关，不同发育阶段的生精细胞对相同刺激因素反应性不同，由此推测生精细胞凋亡有多种调节机制。现研究较多的是在激素和睾丸局部加热诱导下，生精细胞凋亡的调控机制，着也是目前较有希望的男性节育调节手段［4］。生精细胞凋亡具有重要生理意义，参与维持精子发生过程的动态平衡，维持支持细胞与生精细胞的最佳比例，清除基因异常生殖细胞，调节生精过程中精子数量和质量，是机体保持生殖遗传稳定的重要防御机制。在病理状态下，细胞凋亡则导致少精或无精子症发生［5，6］。
2 生精细胞凋亡机制
2.1 Bcl-2蛋白家族 它包括促凋亡的蛋白（Bax、BAD、Bak、Bik、Bok、Diov、Hrk、BID和抑制凋亡的蛋白（Bcl-2、Bcl-xlr、Mcl-1、Bcl-w、Bfl-1/A1）。他们分别控制着细胞死亡通路的各个阶段。Furuchi和Rodriguez发现［7，8］， 过分表达Bcl-2的转基因大鼠，会出现精原细胞增生，并且生精细胞凋亡的机会也减少。Bax缺失的大鼠会导致减数分裂前期生精细胞不正常积累，从而造成生精过程紊乱，以致没有生育能力。另外一些Bcl-w缺失的大鼠也没有生育能力［9］。这些资料都证实了Bcl-2蛋白家族的选择性表达对生精过程异常重要。
2.2 肿瘤抑制蛋白P53 P53蛋白和Bcl-2蛋白家族一样调控着细胞内的死亡信号途径。许多研究报告证明P53在生精细胞的凋亡中起着关键的作用，包括自发性的和损伤诱使的生精细胞的凋亡［10］。缺P53基因的大鼠虽然生长发育正常，也有生育能力，但是在射线作用或实验性隐睾后表现出生精细胞凋亡的滞后，并且凋亡数目也减少［11，12］。尽管大多数的资料表明P53仅调节有丝分裂的生精细胞的活性来控制细胞凋亡，近来也有资料表明它也在生精细胞的减数分裂和减数分裂后期起着关键的作用，从而影响细胞凋亡。
2.3 caspase-3蛋白酶 caspase-3是一种活化胞浆的蛋白酶，它是一种死亡蛋白酶，凋亡细胞通过它的数目的增多从而启动凋亡的级联反应。Kumi-Diaka用5，7，45-三羟异黄铜（genistein）作用于TM4细胞株后［13］，同时发现了细胞的凋亡和坏死并且caspase-3的酶活性提高，因此表明在用genistein引起的睾丸内生精细胞和支持细胞的凋亡可能包括启动caspase-3蛋白激酶这一信号通路的作用。
2.4 Fas/CD95系统 Fas信号系统由相互作用的蛋白Fas（CD95/APO-1）和FasL（CD95L/APO-1L）组成。Fas是属于TNF受体家族的一种I型跨膜蛋白，它广泛存在于各种组织中。FasL是II型的膜蛋白，它以跨膜和可溶性的分泌形式（sFasL）存在［14，15］。sFasL可以在远距离范围内调控表达Fas蛋白的细胞凋亡。免疫组化的结果证明，支持细胞在它们的质膜上表达FasL，而生精细胞则选择表达Fas［16］。现在已有多种证据证明Fas信号系统启动生精细胞的凋亡：（1）在混合培养的支持细胞和生精细胞中加入FasL的反义核苷酸（阻断了FasL的翻译），明显看到生精细胞凋亡数目的减少；（2）Fas和FasL的mRNA的表达量随着动物年龄的不同而不同，在大鼠中是16～33天最多，而此时刚好是大鼠生精细胞凋亡的高峰；（3）加入模拟FasL功能的Fas的激动剂（一种抗Fas的抗体，Jo-2），生精细胞的数目大大减少。此外，在一些有害化合物引起的睾丸损伤中，Fas系统也与生精细胞的凋亡密切相关。Boekelheide［17］用MEHP诱使睾丸损伤的实验表明，随着生精细胞凋亡数目的增多，Fas和FasL的表达量也提高，并相应达到峰值。而且，Fas的活性部分RIP和FAP-1的表达也增多。因此，Fas/FasL是一个重要的旁分泌系统，它不仅影响生精细胞生理条件的凋亡，控制着生精过程的稳态，而且也在有毒物质诱使的睾丸损伤中极大地影响了生精细胞数目。
3 生精细胞凋亡与激素
3.1 睾酮（testosterone,T） 又称生精激素，由睾丸间质细胞合成、分泌。大量研究表明，睾酮水平的降低是生精凋亡的重要原因。利用间质细胞毒性物质——乙基二甲基磺酸盐（EDS）处理大鼠，2天后睾丸中检测不到3β-羟类固醇脱氢酶，8天后凋亡指数增加，长时间EDS处理，粗线期精母细胞和精子细胞的凋亡明显增加［18］。睾酮是通过与支持细胞合成的雄激素受体（AR）特异结合发挥其生物学效应的。睾酮在精原细胞、精母细胞的发育及精子细胞的变态过程起作用，较高水平的睾酮对精原细胞的发育是必须的。睾酮有选择地在生精周期VII-VIII阶段起调节作用。抑制睾酮分泌、VII-VIII期的生精细胞首先发生凋亡［19］。另有研究结果显示，切除大鼠垂体后，睾丸体积明显缩小，精子发生停滞在初级精母细胞阶段，给予大剂量的外源睾酮可重新诱导精子发生。给予成年大鼠甲氧乙酸选择性破坏间质细胞，睾酮血清水平降低，生精细胞凋亡明显增加［20］。
3.2 促卵泡激素 正常精子发生过程需要促卵泡激素（follicle stimulating hormone,FSH）存在。大量研究表明，FSH是灵长类精子发生启动的主要调节者之一，促卵泡激素被拮抗或其水平降低，都能使生殖细胞发生凋亡。FSH通过支持细胞上其唯一的受体FSHR发挥其作用。陈雪雁等［21］提取RNA进行斑点杂交发现FSHR mRNA的杂交信号全部位于支持细胞，于XIII-I期最强，VII-VIII期最弱，在II-VII期处于中等水平。可推测FSH主要作用于XII-I期，调节精原细胞的分裂和精母细胞的减数分裂过程，决定进入精子形成期的圆形精子细胞的数量。缺乏FSH导致粗线期精母细胞凋亡。Tesarik等［22］体外培养生殖细胞和支持细胞发现FSH和睾酮有作用的交叉点，睾酮可增强FSH对生殖细胞凋亡的调控作用，二者协同作用，共同维持正常的精子发生过程。
3.3 促性腺激素释放激素 丘脑下部分泌的促性腺激素释放激素（gonaditrophin-releasinghorm one,GnRH）使垂体释放FSH和LH，FSH、LH分别刺激支持细胞和间质细胞做出应答，为精子发生创造微环境。用GnRH拮抗剂处理大鼠，生精周期特异阶段生殖细胞凋亡明显增加。Sinha-Hikin等［23］发现，给成年大鼠-GnRH拮抗剂后5天（VII-VIII阶段）和7天（VII-VIII和IX-XI阶段）生精细胞凋亡DNA片段明显增加，14天（I、II-IV、V-VI和VII-XIV阶段）达最高值。
3.4 催乳素 关于催乳素（prolactin，PRL）对生精细胞凋亡的研究相对较少，Yazawa等［24］对日本红腹蝾螈睾丸的研究发现，PRL水平提高只会导致生精周期中倒数第2期凋亡发生，推测可能是时间和细胞类型的特殊性引起的，也可能是PRL受体（PRLR）只在倒数第2期表达，或者PRLR全程都表达，只不过在倒数第2期细胞信号系统的组成跟其他期不同所致。他凋亡作用，这主要取决于FSH/ PRL的比例。在分子水平上对PRL促进生精细胞凋亡的研究相当匮乏。用PRL类似物质（CHX）处理后，睾丸内caspase活性有高表达，并且可能由一种新的未经确定的caspase来介导［25］。PRL的许多功能表现为促进增生，但其促进凋亡的机制还有待进一步深入研究。
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