大网膜移植治疗股骨头坏死的实验研究

                  作者：林垂聪 沈权 陈荣华 吴云刚 周光伟 叶澄宇

【摘要】  目的：探讨带蒂大网膜移植激素性股骨头缺血性坏死的疗效。方法：杂种犬9只，应用肌注甲基强的松龙诱导出股骨头缺血坏死动物模型，于第8周在C臂机下行带蒂大网膜移植右侧股骨头术为实验组，将未行任何处理的对侧（左侧）为各自的对照侧。对比两侧股骨头形态、骨小梁结构、骨细胞、骨髓脂肪细胞、骨陷窝，以及毛细血管数、血管直径和超微结构的变化。结果：实验组非手术侧股骨头密度不均匀，有囊性透亮区，出现股骨头变形、股骨头塌陷、股骨头碎裂及髋关节脱位；可见大量空骨陷窝，血管数目相对减少，血管直径相对变细，髓腔内造血细胞减少和肥大的脂肪细胞增多，具有典型的骨细胞变性、坏死征象。实验组大网膜移植侧股骨头毛细血管大量增生，形成状，坏死灶内有大量的新生骨小梁、幼稚的成骨细胞。结论：利用C臂X线机定位钻孔，带蒂大网膜移植能改善犬激素性缺血性坏死的股骨头的微循环，减低骨内压，一定程度上促进了骨的修复。手术创伤小，手术简便。

【关键词】  犬 股骨头坏死 激素 大网膜移植 动物模型

股骨头缺血坏死(avascular necrosis of the femoral head，ANFH)是骨科领域较为棘手的难题之一，病因及发病机制尚未完全明了，治疗方法的选择及其疗效也存在很大争议[1]。血供障碍是股骨头缺血坏死最根本的问题，也是临床治疗首要解决的问题。笔者通过制备激素性股骨头坏死动物模型，观察C臂机下行带蒂多束的大网膜植入以建立网络状的血管再生后对股骨头的修复作用。

    1  实验材料 

    1．1  实验动物  12～14个月龄健康成年杂种犬12只，体重10～13kg，雌雄不限，由温州医学院实验动物中心提供并饲养，动物使用许可证编号SYXK（浙2003?0025）。

    1．2  药物与试剂  甲基强的松龙注射液(辉瑞制药公司，批号：R02159)。10%福尔马林溶液、5%硝酸脱钙、系列酒精、2.5%戊二醛、2%多聚甲醛、5%EDTA、10%锇酸、醋酸钠、柠檬酸均由温州医学院化学实验室提供。

    1．3  实验仪器  普通手术器械、上海华科小型C臂X线机、HB?2型奥林帕斯显微镜、重庆CS101?1型干燥箱、CBQ?Ⅱ型硬质材料超薄切片机及日立H600型透视电镜，由温州医学院和附一提供。

    2  实验方法 

    2．1  造模与分组  12只杂种犬按随机方法分成正常组、模型组、实验1组、实验2组四组，每组3只。正常组肌注生理盐水2ml；其余三组肌注甲基强的松龙16mg/kg，均臀肌注射给药，每周2次，连续8周。正常组、模型组造模第8周麻醉后行X线检查，处死动物后经股骨头病观察，证明造模成功。两实验组在第8周行C臂机下带蒂大网膜移植右侧股骨头术，实验1组、实验2组分别在移植术后第2、4周麻醉后行X线检查，处死动物后经股骨头病理学观察。

    2．2  带蒂大网膜移植术  将实验犬腹部、右髋部脱毛清洁后，按100mg/kg氯氨酮肌注麻醉，麻醉满意后，仰卧位固定于手术台上，清毒铺巾，腹正中切口，长5cm，切开皮肤、皮下、腹直肌鞘以及腹膜，在无血管区将大网膜与横结肠分离，由左向右逐个切断结扎胃大弯和胃网膜动脉弓之间的血管，按大网膜血管分布类型裁剪大网膜，游离足够到达右侧股骨头的长度，并分为2束，每束内必须有一条血管弓，此时大网膜主要由右胃网膜动脉供血。以右侧大转子下为中心，切开2cm纵形切口达大转子下外侧，剥离骨膜。在C臂X线机定位下，用3mm钻在皮质上钻孔，方向对准股骨头的中心，钻孔2个至软骨下。用长钳在两切口间打通皮下隧道。将大网膜用牵引线通过皮下隧道牵引达右髋部切口，并将大网膜固定于腹膜上，注意避免缝合过紧影响大网膜的血液供应，切忌大网膜扭转或过分强力拖拉，否则易损伤大网膜，甚至发生血栓形成，严重者可因缺血而致部分坏死。将分束的大网膜分别用细克氏针送入骨孔至软骨下，逐层缝合腹部及右髋部创口，固定敷料。术后分笼饲养。术后3天每天肌肉注射青霉素针40万u。

    2．3  大体观察  术后观察动物饮食、活动及切口情况。取材后观察股骨头有无塌陷变形。再沿股骨头冠状面剖开，肉眼观察原缺损区修复情况。

    2．4  影像学观察  各组动物实验到期麻醉后，同等条件下摄髋关节X线平片（额定电压55kV），观察股骨头形态、骨质密度、骨小梁。

    2．5  光镜观察  处死动物，取出两侧股骨头，沿冠状面剖开，10%福尔马林溶液固定，5%硝酸脱钙，系列酒精脱水，常规石蜡包埋，切片厚4μm，HE染色，光镜下观察股骨头下区骨小梁结构、骨细胞、骨髓脂肪细胞、骨陷窝的变化，高倍镜下任选5个高倍视野，每个视野计数50个骨陷窝，计数空缺的骨陷窝数(表示骨细胞已坏死)占正常骨陷窝的百分比，求出空骨陷窝率。观察血管数、血管直径，并求出平均值。

    2．6  电镜检查  从股骨头冠状面取1mm3左右的骨组织2～3块，置于2.5%戊二醛和2%多聚甲醛混合液中预固定，5%EDTA脱钙，10%锇酸固定，Epon812包埋，制超薄切片，片厚600μｍ，醋酸钠、柠檬酸铅染色，透射电镜观察骨组织内的超微结构。

    2．7  统计学方法  数据采用（±s）表示，t检验。

    3  实验结果 

    3.1  一般情况  所有动物术后当天开始进食，切口无感染，无动物死亡。模型组、实验1组、实验2组三组犬体形未见明显变化，但较正常组犬消瘦，皮下脂肪变薄，毛枯而无光泽。两实验手术组动物伤口均Ⅰ期愈合。

    3.2  股骨头标本大体情况  模型组股骨头较正常组骨质松脆，易于凿切，骨质明显疏松，软骨有黄色坏死灶，部分股骨头关节面毛糙。实验1组关节软骨呈苍白色，关节软骨轻度剥脱。手术侧与非手术侧股骨头比较，轮廓无明显差异，但手术侧剖面较非手术侧呈红色。实验2组关节软骨剥脱比模型组、实验1组加重，有1个股骨头塌陷，部分关节软骨下骨轻度暴露，软骨呈苍白色，但手术侧剖面较非手术侧骨小梁结构清晰。

    3.3  X线观察  正常组股骨头形态完整，关节面清晰，股骨头骨密度均匀。模型组股骨头外形尚规则，可见股骨头关节面模糊，骨质结构不清晰，骨缺损周围壁有硬化带形成，股骨头密度不均匀，股骨头内有囊性透亮区。实验1组股骨头变形，骨质疏松，股骨头内囊性变进一步扩大，两侧股骨头比较无明显区别。实验2组股骨头明显变形，出现股骨头塌陷、股骨头碎裂，手术侧股骨头密度均匀，骨质结构清晰。

    3.4  光镜观察  正常组软骨细胞排列整齐，骨小梁完整、排列规则，骨小梁中的骨细胞清晰可见，核较大、位于中央，空骨陷窝少见，骨髓中造血细胞丰富，脂肪细胞相对较少，形态正常。模型组软骨退变，软骨细胞数目减少，骨小梁较稀疏、变细、结构紊乱，骨细胞减少、部分核深染，可见大量空骨陷窝，血管数目相对减少，血管直径相对变细，血管壁有炎性改变，髓腔内有减少的造血细胞和增多的肥大的脂肪细胞。实验1组、实验2组的非手术侧股骨头骨小梁数目减少、模糊，间隙略增大，可见有大量空骨陷窝的坏死，骨小梁出现断裂，髓内脂肪细胞增大并融合成片。较多的细胞核固缩、核偏位、染色深，骨髓内大量脂肪细胞堆积。骨髓弥漫出血坏死，造血细胞坏死、减少明显，局部骨髓淀粉样变性、纤维化，血管明显减少，血管结构模糊，血管直径明显变细。两实验组手术侧股骨头软骨中软骨细胞增生，排列整齐，骨小梁周边偶见破骨细胞及多个并排排列的成骨细胞，骨质有较多明显修复，骨小梁间隙存在大量的骨髓细胞，骨髓内脂肪空泡较非手术侧减少，毛细血管大量增生，以实验2组的手术侧更明显，增生的毛细血管形成状。四组股骨头毛细血管数和血管直径及空缺骨陷窝百分比检查结果见表1。表1  四组股骨头光镜检查结果

    与正常组比较，△P＜0.01；与同组非手术侧比较，*P＜0.053.5  电镜观察  正常组骨小梁致密，排列规则，骨基质中散在有骨细胞，陷窝明显，表面胶原纤维排列规则紧密。骨细胞位于骨陷窝内，细胞核大，胞浆丰富，富含粗面内质网，多聚核糖体多，线粒体发达，骨小梁可见增生活跃的骨髓组织。模型组骨小梁边缘成骨细胞胞质菲薄，部分区域几乎消失。骨基质表面胶原纤维排列散乱，骨小梁表面的成骨细胞少，骨细胞核成固缩状态，胞质内线粒体嵴断裂，粗面内质网明显减少，骨陷窝变小，形成凋亡细胞的改变。两实验组非手术侧骨小梁断裂、塌陷，骨基质排列紊乱，走行无性，骨细胞胞浆中出现脂滴，可见核膜溶解，染色质浓集或细胞核固缩、碎裂，细胞质中溶酶体含量增多，具有典型的骨细胞变性、坏死征象。两实验组手术侧坏死灶内有大量的新生骨小梁、幼稚的成骨细胞，基质密度增大，排列整齐，骨细胞发育正常，成骨细胞内可见大量粗面内质网，附有核蛋白体。

    4  讨  论

    激素性股骨头缺血坏死的发病机制有:①脂肪栓塞学说。体内大量摄入激素使血清脂类物质含量升高，超过肝脏的代谢能力引起高脂血症，在周围血管中形成脂肪栓子，导致股骨头内微血管脂肪栓塞，导致瘀血停滞引起股骨头内压增高，股骨头内骨细胞因缺血，缺氧而发生坏死,从而形成激素性股骨头坏死[2]。Wang[3]发现大剂量应用激素引起高血脂后，骨髓内脂肪细胞大量增殖肥大，仅脂肪细胞的肥大就能增加髓内脂肪体积的25%～28%，压迫微血管，使静脉回流受阻，骨内压升高，最终导致骨股头缺血性坏死。另外，股骨头微血管内脂肪栓子分解后产生的脂肪酸，伴前列腺素E2、血栓素B4和白三烯B4增多导致骨内小血管损害和炎症，使血管通透性增大，触发骨内出血和血供中断，最终引起骨缺血性坏死[4]。本实验中动物大剂量摄入激素8周后,股骨头部骨髓组织中脂肪堆积,脂肪细胞异常肥大,压迫小静脉,使受压处管腔变窄,从而使静脉回流受阻,又使骨内压异常增高而加重股骨头缺血,造成骨内恶性循环,导致股骨头缺血坏死。②血液流动学说。大量激素进入体内后引起骨内小血管炎症加重，骨内压明显升高，而股骨头、肱骨、股骨髁等球形松质骨部位因受坚硬壁限制，骨内压升高最为明显。髓内血窦、毛细血管、小静脉受压后造成静脉血流受阻，血液回流出现延迟或瘀滞现象，直接影响骨组织内动脉血供，造成骨组织的缺血坏死[5]。本实验采用激素方法造成股骨头坏死，造模成功。股骨头内毛细血管数量减少，管径变细，血管内有少量嗜伊红物质沉积,血管呈裂隙状、分枝状,也证实有微血管的损害。

    大网膜内富含血管、淋巴管、脂肪组织和巨噬细胞，具有再生能力强，易与其他组织发生粘连而形成广泛侧支循环，较强的吸收、修复功能。大网膜连于胃大弯与横结肠之间，易于解剖，有完善的互相沟通的血管网络，便于裁剪塑形，取材方便且血管蒂长、可塑性大，移植后伸展范围广。带蒂大网膜移植股骨头坏死机制：①通过钻孔使骨内压在一定程度上得以减轻。②大网膜血管成网络状，并具有较强的再生能力，在股骨头内的三维立体植放，可较快的形成更广泛的血管吻合网络，恢复整个股骨头内的血运。③大网膜除了有动脉、静脉、淋巴管以外，还有其他组织所不具有的“乳斑”，这些均有极强的回吸收功能，对解决股骨头缺血性坏死时骨髓内血流淤滞、压力升高乃至静脉栓塞极为有利，是其他治疗方法所不能比拟的[6]。

    与[7，8]比较,本实验利用C臂X线机定位钻孔，使手术创伤更小，手术更简便，多束大网膜植入使血管再生形成网络状。大网膜移植术后2周，软骨中软骨细胞增生，排列整齐，骨小梁周边偶见破骨细胞及多个并排排列的成骨细胞，骨质有较多明显修复，骨小梁间隙存在大量的骨髓细胞，骨髓内脂肪空泡较对侧减少，毛细血管大量增生，电镜坏死灶内有大量的新生骨小梁、幼稚的成骨细胞，基质密度增大，排列整齐，骨细胞发育正常，成骨细胞内可见大量粗面内质网，附有核蛋白体。术后4周增生的毛细血管形成网络状。

    本实验手术中没有植骨，可能使原本已脆弱的软骨下骨的支撑力进一步减弱，是本实验不足之处。

【文献】
  1 Lieberman JR,Berry DJ,Mont MA,et al.Osteonecrosis of the hip management in the twenty?first century.J Bone Joint Surg(Am),2002，84(5):834?853

2 周 强,李起鸿,杨 柳,等.大剂量糖皮质激素诱导兔股骨头坏死的研究.第三军医大学学报,2000，22(3):249?252

3 Wang GJ. Fat～cell changes as a mechanism of avascular necrosis on the femoral head in cortisone～treated rabbits.J Bone Joint Surg(Am)1997，59:729

4 Frangogiannis NG,Smith CW,Entman ML.The inflammatory response in myocardial infarction.Cardiovasc Res,2002,53(1):31?47

5 胡志明,王海彬,李祖国，等.激素性股骨头坏死模型的建立及病理和影像学特征.广东药学院学报,2006,22（2）：181?184

6 贾卫斗,白桂有,杨博贵.带蒂大网膜移植术治疗成人股骨头缺血性坏死的疗效观察.骨与关节损伤杂志,2006,21(5):376?377

7 贾卫斗,郭开生,祝清华,等.股骨头坏死模型及大网膜移植后的病理观察.中国实验动物学杂志,1994,4(1):26?30

8 陈华军,陈 辉,衡建伟,等.大网膜移植治疗股骨头坏死的实验研究.骨与关节损伤杂志,2003,18(10):690?691