不同治法中药复方对H22肝癌小鼠瘤质量和体质量及免疫功能的影响
作者：周阿高, 张勇, 蒉纲, 孔德云, 葛海良
任秋华, 董佳容, 洪声, 毛旭明, 王颖, 张惠珍, 王树军
【摘要】 比较不同治法的中药复方对H22肝癌小鼠瘤质量、体质量及免疫功能等的影响。方法：选择移植性肝癌H22小鼠为模型，观察不同治法的中药复方常规水煎剂的抑瘤作用，并通过检测各组小鼠T淋巴细胞增殖功能、杀伤细胞（natural killer, NK）杀伤功能、T淋巴细胞表型变化及γ干扰素（interferon-γ, IFN-γ）和白细胞介素-4（interleukin-4, IL-4）含量来比较免疫功能状况。结果：以毒攻毒组小鼠瘤质量显著小于其他各组小鼠，抑瘤率达65.8％（P<0.01）；其他4组抑瘤率在10.1％～17.1％之间。以毒攻毒组小鼠体质量明显下降，出现脱毛现象；扶正培本组小鼠毛发生长良好，活泼好动。以毒攻毒组小鼠T淋巴细胞转化刺激指数（stimulation index, SI）增加显著（SI=4.34，P<0.01），说明以毒攻毒组小鼠T细胞具有较强的增殖能力；其余各组小鼠SI均低于3，表明这些组的小鼠T细胞无明显增殖作用。清热解毒、活血化瘀和以毒攻毒组小鼠NK细胞百分数显著增高，分别为生理盐水组的5.05、4.07和5.17倍（P<0.01）；扶正培本和化痰散结组小鼠NK细胞杀伤活性未见显著升高。IFN-γ检测结果显示，以毒攻毒组小鼠T细胞分泌IFN-γ能力显著升高（P<0.05）；IL-4检测结果显示，除扶正培本组外，清热解毒、活血化瘀、化痰散结和以毒攻毒组小鼠T细胞分泌IL-4的能力也均显著升高（P<0.01）。结论：以毒攻毒法能有效抑制肿瘤细胞的生长，明显增强小鼠细胞和体液免疫功能；扶正培本法则有良好的强壮作用。
【关键词】 中医治法; 中药复方; 肝癌;体质量; 免疫力; 小鼠
Objective: To compare the influence of traditional Chinese compound recipes (TCCRs) with different efficacy on body weight, tumor weight and immune function in H22 cancer-bearing mice.
Methods: H22 cancer-bearing mice were chosen to observe the effects of TCCRs with different efficacy on tumor growth inhibition and detect the proliferation function of T lymphocytes, the activity of natural killer (NK) cells, the changes of T lymphocytes and the content of interferon-γ (IFN-γ）and interleukin-4 (IL-4).
Results: Tumor weight of H22 cancer-bearing mice in Yidu Gongdu Recipe (YDGDR, a compound traditional Chinese herbal medicine using poison as an antidote for poison)-treated group was obviously lighter than that in the other TCCR-treated groups and the tumor inhibition rate in YDGDR-treated group was 65.76% (P<0.01). The tumor inhibition rates in other TCCR-treated groups were ranged from 10.1％ to 17.1%. Body weight of mice in YDGDR-treated group was obviously decreased and depilation was observed at the same time. Pelage of mice in Fuzheng Peiben Recipe (FZPBR, a compound traditional Chinese herbal medicine for supporting the healthy energy)-treated group grew well, and behavior of the mice was active. Stimulation index (SI) of T lymphocyte transformation in YDGDR-treated group was obviously increased (SI=4.34, P<0.01), which showed the proliferation function of T lymphocyte was very strong. The SI of T lymphocyte transformation in the other groups was less than three, which showed the proliferation function of T lymphocytes was not significant. Compared with normal saline (NS)-treated group, percentages of NK cells in Qinre Jiedu Recipe (QRJDR, a compound traditional Chinese herbal medicine for clearing away heat and toxic substances)-treated, Huxue Huayu Recipe (HXHYR, a compound traditional Chinese herbal medicine for activating blood circulation to dissipate blood stasis)-treated and YDGDR-treated groups were obviously increased and 5.05, 4.07 and 5.17 times more than the NS-treated group, respectively (P<0.01). The activity of NK cells wasn’t increased in the FZPBR-treated and HXHYR-treated groups. The production of IFN-γ induced by T cells in YDGDR-treated group was obviously raised (P<0.05), and the production of IL-4 induced by T cells in QRJDR-treated, HXHYR-treated, Huatan Sanjie Recipe (a compound traditional Chinese herbal medicine for eliminating phlegm and resolving masses)-treated and YDGDR-treated groups was also raised obviously (P<0.01).
Conclusion: YDGDR has a good effect of inhibiting tumor growth and can reinforce cellular and humoral immune function in tumor-bearing mice. FZPBR can strengthen the body.
Keywords: therapeutic methods, traditional Chinese medicine; composite (traditional Chinese drugs); liver cancer; body weight; immunity; mice
肿瘤是临床常见病，运用传统中医疗法肿瘤是的一大特色。目前中医治疗肿瘤主要分为扶正培本、清热解毒、活血化瘀、化痰散结、以毒攻毒等5种方法，临床医生大多使用其中的一种或几种方法治疗肿瘤，根据［1-6］报道，这些方法都有不同程度的临床疗效。由于的作者来自不同省市及不同的医疗机构，导致即使是治疗同一癌肿的论文，也很难就其临床疗效作一比较，以确定哪种治疗方法更为有效。本研究以肝癌（H22）小鼠为模型，观察并比较了不同治法的中药复方对肝癌荷瘤小鼠瘤质量、体质量及免疫功能等的影响。
1 材料和方法
1.1 实验材料
1.1.1 中药制备 扶正培本方由黄芪、当归等组成，经水煎浓缩后，相当于含生药1.2 g/ml；清热解毒方由黄连、黄柏、黄芩、栀子等组成，经水煎浓缩后，相当于含生药0.66 g/ml；活血化瘀方由大黄、庶 虫虫等组成，相当于含生药1.0 g/ml；化痰散结方由半夏、陈皮、茯苓等组成，经水煎浓缩后，相当于含生药0.84 g/ml；以毒攻毒方由斑蝥、陈皮、谷芽等组成，经水煎浓缩后，相当于含生药0.01 g/ml。
1.1.2 动物 C57BL/6小鼠，雄性，10周龄，购自中国院上海实验动物中心。
1.1.3 瘤株 肝癌H22瘤株，由上海市免疫学研究所提供。
1.1.4 试剂 刀豆蛋白A（concanavalin A, Con A），Sigma公司产品；CD3、CD4、CD8单抗（eBioScience公司）；自然杀伤细胞（natural killer, NK）试剂（上海市免疫研究所自配）；氚-胸腺嘧啶核苷（tritiated thymidine, 3H-TdR）（上海原子能研究所）；γ干扰素（interferon-γ, IFN-γ）和白细胞介素-4（interleukin-4, IL-4）检测试剂盒（深圳晶美生物工程有限公司）。
1.2 实验方法
1.2.1 造模方法 无菌条件下取生长7～9 d传代接种的H22细胞株，将5×106个细胞接种于每只小鼠右侧腋窝皮下。
1.2.2 动物分组及给药方法 小鼠70只，10只作为正常组，其余均按上法造模。小鼠接种肿瘤5 d后，随机分成生理盐水组、扶正培本组、清热解毒组、活血化瘀组、化痰散结组和以毒攻毒组，共6组，每组10只，生理盐水组予以生理盐水处理，其余各组给予相应的中药水煎液，均灌胃0.2 ml/只，连续给药15 d。
1.2.3 标本采集 停药次日，断颈处死小鼠，剥离肿瘤组织并无菌取脾。
1.3 检测指标
1.3.1 小鼠体质量、瘤质量及抑瘤率 胃饲15 d后，称取各组小鼠体质量；处死小鼠后完整剥离肿瘤，用天平称取瘤质量，抑瘤率。抑瘤率（%）=（生理盐水组瘤质量－中药复方组瘤质量）/生理盐水组瘤质量×100。
1.3.2 T淋巴细胞增殖功能 采用3H-TdR掺入法。在96孔平底培养板中，每孔加入小鼠脾细胞悬液100 μl，浓度为5×106/ml，三复孔培养。同时，分别加入ConA 10 μl。于37 ℃、5％ CO2条件下培养72 h。终止培养前16 h，每孔加入3H-TdR 1 μCi。用细胞收集仪将细胞收集于玻璃纤维滤纸上，β-液闪仪测定每分钟计数（counts per minute, cpm），并计算刺激指数（stimulation index, SI）。
1.3.3 NK杀伤功能 用1640培养液分别调整小鼠脾细胞（效应细胞）和体外培养的K562细胞（靶细胞）浓度为5×106/ml和1×105/ml。按效应细胞∶靶细胞＝50∶1比例，各取100 μl加入96孔平底培养板，37 ℃、5％ CO2条件下共同培养4 h。并设自然释放和最大释放组作为实验阴阳性对照。然后1 000 r/min，离心5 min。吸取上清100 μl，加入底物液100 μl，静置3 min显色。再加入100 μl HCl终止反应，490 nm波长读取OD值。计算NK细胞的杀伤百分率。
1.3.4 T淋巴细胞表型 采用直接免疫荧光及流式细胞仪分析。取小鼠脾细胞1×106个，加入适量PE-Cy5-CD3、FITC-CD4和PE-CD8混合单抗，室温避光孵育20 min。1 000 r/min，离心5 min，洗涤2次后，加入300 μl固定液，上机检测。
1.3.5 细胞因子 采用酶联免疫吸附（enzyme linked immunosorbent assay, ELISA）法测定。收集小鼠脾细胞经ConA刺激24 h后的培养上清，按照细胞因子检测试剂盒操作说明分别测定IFN-γ和IL-4的含量。
1.4 统计学方法 采用SAS软件方差分析统计各组别数据差异的统计学意义。
2 结 果
2.1 不同治法的中药复方对荷瘤小鼠体质量、瘤质量及抑瘤率的影响 与正常组比较，以毒攻毒组小鼠体质量下降明显（P<0.01），其他各组荷瘤小鼠体质量均无明显下降（P>0.05）。与生理盐水荷瘤对照组比较，不同中药复方组小鼠瘤质量均小于对照组，有一定的抑瘤作用，其中尤以以毒攻毒方的抑瘤作用最明显，抑瘤率达65.76％，与其他各组比较，差异有统计学意义（P<0.01），表明以毒攻毒中药能有效抑制小鼠肝癌细胞的生长。另外，该组小鼠同时还伴有脱毛现象，提示以毒攻毒中药具有一定的毒副作用。扶正培本组小鼠毛发光泽亮丽，活泼好动，四肢有力，提示扶正培本中药有强壮作用。见表1。
2.2 不同治法的中药复方对荷瘤小鼠T淋巴细胞增殖的影响 与正常组比较，各组小鼠T淋巴细胞转化功能均显著降低（P<0.01），表明各组小鼠免疫功能低下。与生理盐水荷瘤对照组比较，不同中药复方组小鼠T淋巴细胞转化功能均有不同程度的增加，其中以服用以毒攻毒中药小鼠T淋巴细胞转化刺激指数增加更为显著（SI=4.34, P=0.001 29)，具有较强的增殖能力。说明以毒攻毒中药能显著上调荷瘤小鼠的T淋巴细胞增殖功能，其余各方对T细胞增殖无明显影响。见表2。表1 不同治法的中药复方对荷瘤小鼠体质量及瘤质量的影响（略）表2 不同治法的中药复方对荷瘤小鼠T淋巴细胞增殖的影响（略）
2.3 不同治法的中药复方对荷瘤小鼠NK、T细胞亚群变化的影响 生理盐水荷瘤对照组NK细胞杀伤活性与正常对照组比较，差异无统计学意义，说明罹患肝癌后，并不能有效地刺激小鼠NK细胞产生针对肿瘤的免疫应答；清热解毒、活血化瘀和以毒攻毒组小鼠NK细胞杀伤活性显著增高，分别为生理盐水组的5.05、4.07和5.17倍（P<0.01），说明这些中药均能显著增强荷瘤小鼠NK细胞的杀伤功能；扶正培本和化痰散结组小鼠NK细胞杀伤活性未见显著升高。见表3。
此外，与正常对照组比较，各组小鼠T细胞数量均明显下降（P<0.05），说明其免疫功能低下，而生理盐水荷瘤对照组小鼠外周T细胞亚群比例发生明显变化，主要体现在CD4+/CD8+比值（0.80）倒置，这可能是因为发生肿瘤后，小鼠体内肿瘤特异性CD8+ T细胞克隆增殖所致；与之相类似，以毒攻毒、化痰散结组小鼠CD4+/CD8+比值也明显倒置，表明该两组小鼠体内可能也存在较强的肿瘤特异性细胞免疫应答。见表3。
在正常情况下，CD4+/CD8+比值应该大于1，但在机体带瘤状态下，机体可产生应激反应，并促进CD8+ T细胞增殖，CD4+/CD8+比值因而发生倒置，但CD8+ T细胞数量的升高却有助于机体杀伤肿瘤细胞；而CD4+CD25+调节性T细胞是一种抑制性T细胞，能抑制CD8+ T细胞的杀伤功能，从而有助于肿瘤的生长。扶正培本、清热解毒和活血化瘀组CD4+/CD8+比值接近或超过正常组，但肿瘤生长仍比较明显，这是因为CD4+CD25+调节性T细胞及其他抑制性细胞抑制了CD8+ T细胞抗肿瘤作用的发挥，故肿瘤生长未得到明显抑制。以毒攻毒组CD4+/CD8+比值虽接近生理盐水荷瘤对照组，但抑瘤作用较好，可能是因为以毒攻毒中药抑制了CD4+CD25+调节性T细胞及其他抑制性细胞，致使CD8+ T细胞能发挥抗肿瘤的作用，因而有较好的抑瘤作用。见表3。
2.4 不同治法的中药复方对荷瘤小鼠分泌细胞因子能力的影响 IFN-γ测定显示，与生理盐水荷瘤组相比，以毒攻毒中药组小鼠T细胞分泌IFN-γ能力显著升高（P<0.01）；扶正培本组和化痰散结组小鼠T细胞分泌IFN-γ能力也显著升高（P<0.05），说明以毒攻毒方、扶正培本方和化痰散结方能显著上调CD4+ Th1细胞的分泌能力，并进而上调小鼠细胞免疫功能，促进CD8+细胞毒性T细胞的抗肿瘤作用。IL-4检测结果显示，除扶正培本中药组外，清热解毒、活血化瘀、化痰散结和以毒攻毒中药组小鼠T细胞分泌IL-4的能力均显著升高（P<0.01），说明这些治法的中药均能显著上调CD4+ Th2细胞的分泌能力，并进而上调小鼠体液免疫功能。见表4。表3 不同治法的中药复方对荷瘤小鼠NK、T细胞亚群变化的影响（略）表4 不同治法中药复方对荷瘤小鼠分泌（略）
3 讨 论
肿瘤是一种常见病、多发病，严重危害病人的生命健康，研究传统中医肿瘤的不同治法在抗肿瘤中的作用，有助于促进传统中医治疗肿瘤大法的理论研究，进而提高中医治疗肿瘤的临床疗效。
以毒攻毒中药可以明显抑制荷瘤小鼠肿瘤的生长，抑瘤率高达65.8％（P<0.01），但小鼠体质量明显降低，出现脱毛现象，说明其既能有效杀死肿瘤细胞，又具有一定的毒副作用。其次是活血化瘀中药和化痰散结中药，抑瘤率分别为17.1％和16.6％；扶正培本中药和清热解毒中药抑瘤作用不明显，抑瘤率仅为11.4％和10.1％，但扶正培本组小鼠毛发生长良好，活动能力强，表明扶正培本中药有较好的强壮作用。
抗肿瘤作用最好的以毒攻毒方抗肿瘤免疫反应作用也很明显，主要表现在它能明显促进T淋巴细胞增殖（P<0.01），并改变T淋巴细胞亚群比例，说明其具有增强细胞免疫作用。清热解毒中药和活血化瘀中药分别能明显促进荷瘤小鼠机体T淋巴细胞亚群增殖和NK细胞活性（P<0.01），并且两组小鼠T细胞分泌IL-4的能力也显著升高（P<0.01），说明清热解毒中药和活血化瘀中药能增强荷瘤小鼠的细胞免疫和体液免疫功能。
化痰散结中药促进荷瘤小鼠分泌细胞因子IFN-γ和IL-4的能力较其他中药复方强，但对增强T细胞和NK细胞增殖能力无明显作用；扶正培本中药对提高荷瘤小鼠机体免疫功能多项指标的作用均不明显。
综合以上各实验结果，清热解毒、活血化瘀和化痰散结中药虽然能促进小鼠的体液免疫应答能力，但由于在肿瘤免疫应答过程中起主导作用的是CD8+ T细胞介导的细胞免疫应答，因此这些中药组小鼠体内肿瘤生长未见明显抑制；扶正培本中药对提高荷瘤小鼠机体免疫功能多项指标的作用均不明显，也没有明显抑制荷瘤小鼠肿瘤生长，这与某些［7］的报道不一致，值得再进一步研究。以毒攻毒中药既能上调小鼠的细胞免疫功能，又能有效刺激小鼠的体液免疫功能，因此能有效抑制小鼠肿瘤的生长，故以毒攻毒法应该成为中医治疗肿瘤的主要方法之一。以毒攻毒中药有一定的毒副反应，可出现体质量下降和脱毛现象，而扶正培本中药能使荷瘤小鼠毛发亮丽而有光泽，且活泼好动，显示了较好的强壮作用。
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