异位宁对实验性大鼠子宫内膜异位症表皮生长因子受体的影响
【摘要】 目的：探讨异位宁对实验性大鼠子宫内膜异位症表皮生长因子受体表达水平的影响。方法：以免疫组化法定性检测各组子宫内膜异位大鼠的表皮生长因子受体(EGFR)的表达水平。结果：模型对照组EGFR的阳性表达率偏高，与正常对照组比较有显著差异，异位宁高剂量组中EGFR的阳性表达率明显偏低，与模型对照组相比有显著差异(P<0.01)。结论：异位宁可以抑制异位内膜血管的形成，从而抑制异位子宫内膜增生,为研究子宫内膜异位症的发病机制开拓了新途径。
【关键词】 子宫内膜异位症 异位宁 表皮生长因子受体 大鼠
子宫内膜异位症(endometriosis,EM)是指具有生长功能的子宫内膜组织出现在子宫腔被覆黏膜以外的身体其他部位。由于诊疗技术的不断提高，EM的诊断率不断上升。而在内异症中，异位内膜病灶的生长需要新的血管供应， EGF是血管生长因子家族中的一员，可以刺激血管内皮细胞生长和体内新生血管形成。而EGF受体(epidermal growth factor receptor，EGFR)是表皮生长因子(EGF)及转化生长因子的共同受体［1?5］。本研究采用免疫组化法定性检测各组子宫内膜异位大鼠的表皮生长因子受体(EGFR)的表达水平，探讨异位宁对EGFR表达的影响。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 实验动物 选用Wistar雌性未孕大鼠，体重(200+20)g，鼠龄8～12周，购自黑龙江中医药大学实验动物中心，微生物控制等级为壹级。
1.1.2 实验药物 异位宁:由赤芍、柴胡、蓬莪术、延胡索、蜈蚣、黄芩、金银花、薏苡仁、秦艽、牡蛎等中药组成，购自黑龙江中医药大学附属，上药共计200 g，加水700 mL，浸泡30 min，头煎武火40 min，取汁200 mL，二煎文火30 min，取汁200 min,二煎共得药液400 mL，文火浓缩至100 mL，加95%乙醇200 mL，置冰箱静止24 h离心(1 600转／min)，取上清液250 mL，置水浴锅提取乙醇，取药液40 min，相当于每毫升含生药5 g，置于4℃冰箱内备用。达那唑：100 mg/粒，上海华联制药有限公司生产，生产批号：20040902。EGFR免疫组化染色试剂盒免疫组化常用辅助试剂：武汉博士德生物工程有限公司。
1.2 方法
1.2.1 造模方法 雌性未孕Wistar大鼠，体重(200±20)g，皮下注射乙烯雌酚0.2 mg/只促情，以20％乌拉坦1.5 g／kg注射麻醉，待麻醉生效后，将大鼠固定操作台上，腹部剪毛，碘伏消毒，在无菌条件下开腹，约1.5 cm长，右侧离卵巢0.5 cm处分离子宫，结扎后在中间剪取约2 cm一段子宫，剖开子宫剥离子宫内膜，将内膜剪成3块，分别缝于子宫分叉处、左侧卵巢附近、左侧腹膜壁层，关腹缝合。每鼠注射庆大霉素0.1 mL，连用3 d，正常清洁饲养。
1.2.2 分组观察 正常饲养1个月后，随机抽取10只造模大鼠2次开腹。可见移植宫内膜体积增大，部分增大物内含液体物质，部分增大物表面被结缔组织包裹，大网、肠管、腹壁广泛粘连。此后开始灌胃给药。正常对照组：每日灌服等容量蒸馏水。模型组：模型动物术后1月开始，每日灌胃等容量的生理盐水。异位宁高剂量组：模型动物术后1月开始，每日以5.4 g/100 g异位宁药液灌胃。异位宁低剂量组：模型动物术后1月开始，每日以1.8 g/100 g异位宁药液给大鼠灌胃。西药对照组：模型动物术后1月开始，每日以3.6mg/100 g达那唑混悬液给大鼠灌胃。均给药4周后断头处死，剖取大鼠在位及异位子宫内膜组织，分为3部分分别放入10%福尔马林中供做免疫组化的石蜡切片。
1.2.3 实验方法 EGFR采用免疫组织化学方法检测：(1)石蜡切片厚度5 μm，裱于Poly?L?lysine处理过的载玻片上，置45℃温箱拷片24 h。(2)切片常规加水。(3) 3%H2O2室温10 min，灭活内源性酶，蒸馏水冲洗，PBS浸泡5 min。(4)热修复抗原：将切片浸入0.01 M枸橼酸盐缓冲液，微波炉加热，温度保持在95℃，持续10 min。取出容器，室温冷却20 min，PBS洗涤。(5)滴加复合消化液，室温5～10 min，PBS洗涤2 min／次，共3次。(6)滴加正常山羊血清封闭，室温孵育10 min。(7)倾去血清，滴加适当比例稀释的一抗，置于湿盒内37℃温箱孵育60 min，PBS洗涤，5 min／次，共3次。(8)滴加生物素二抗，37℃温箱孵育20 min，PBS洗涤，5 min／次，共3次。(9)滴加链霉亲和素?过氧化物酶，置于湿盒内37℃温箱孵育20 min，PBS洗涤，5 min／次，共3次。(10)DAB显色，显色10 min，蒸馏水洗。(11)苏木素轻复染，蒸馏水洗，树脂胶固定，显微镜观察。
1.3 统计学方法 实验数据均采用均数加减标准差(±s)表示，组间比较采用秩和检验。
2 结果
各组大鼠局部组织EGFR表达结果比较：见表1。
表1 各组大鼠局部组织EGFR表达结果（略）
注：与模型组比较，#P＜0.05，##P＜0.01
3 小结
本实验通过探讨EGFR在实验性大鼠在位与异位内膜上的表达，及异位宁对EGFR表达的影响，免疫组化实验结果表明，模型对照组EGFR的阳性表达率偏高，与正常对照组比较有显著差异(P＜0.05)。在内异症中，异位内膜病灶的生长需要许多新的血管供应，由此我们推测EGFR与EGF结合后，通过促有丝分裂的作用，促进细胞增殖，进而促进异位子宫内膜增生，而异位宁高剂量组中EGFR的阳性表达率明显偏低，与模型对照组相比有显著差异(P＜0.01)，表明异位宁可以抑制异位内膜血管的形成，从而抑制异位子宫内膜增生。
【】
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