紫杉醇长效注射缓释微球的体内外评价
【摘要】 目的:制备以PLGA为载体材料的紫杉醇长效注射缓释微球，并对其体内外释药、抑瘤效果等进行评价。方法:使用改良的单乳溶剂蒸发法制备紫杉醇长效缓释微球，通过分析粒径分布、包封率、体外释放效果、白细胞水平及体内抑瘤效果等指标，对其进行评价。结果:所得微球平均粒径小于10μm，包封率大于80%，体外能持续释放30d。对裸鼠体内的前列腺PC-3M肿瘤的抑制率为60.35%。结论:以PLGA为载体材料制备的紫杉醇长效缓释微球提高了紫杉醇的溶解性，延长了药物的释放时间，并在体内长时间有效抑制肿瘤的生长速度，具有较好的抑瘤效果和较低的血液毒性。
【关键词】 紫杉醇;微球;抑瘤实验;血液毒性
紫杉醇是一种从太平洋红豆杉树树皮中提取的有效抗肿瘤药［1-2］ 。本文研究的目的是制备一种以生物可降解聚合物PLGA［poly（D，L-lactic-co-glycolic acid）］为材料的紫杉醇微球，这种微球体外释放长达30d，体内注射28d后，未表现出明显的血液毒性。荷PC-3M肿瘤裸鼠20d可以有效抑制肿瘤细胞生长，抑瘤率为60.35%。
1 材料与方法
1.1 材料 紫杉醇购自重庆美联制药有限公司;PLGA（75.25，50.50，M.W.10000～40000）购自山东省医疗器械研究所;聚乙烯醇（PVA），吐温80、吐温20、二氯甲烷（DCM）和乙腈均购自于北京化学试剂公司。
1.2 紫杉醇微球的处方筛选 采用改良的单乳溶剂蒸发法制备紫杉醇微球。适量紫杉醇和PLGA溶解于DCM中，此溶液保存于4℃以防止DCM的挥发。将此溶液逐滴加入至20ml高浓度的PVA溶液中，高速搅拌1min。之后将外水相稀释至2%（w.v）的浓度，于室温以300r.min的速度持续搅拌2h，挥发掉DCM。然后将该溶液冷冻离心10min，弃去上清液，蒸馏水反复洗涤沉淀，最后冷冻干燥。
1.3 微球的物理性质 粒径的测定:用激光粒度分析仪（OMEC Ls800，珠海欧美克公司）测量粒子大小。微球电镜扫描:获得的微球通过电镜（JE-OL，JSM-5600LV）扫描得到其外部形状和表面特征。
微球中紫杉醇含量的测定:用HPLC分析测定PLGA微球中包含的紫杉醇含量。取3mg紫杉醇微球溶解于1ml的DCM，之后再加入5ml的乙腈:水（50:50，v.v）的溶液，并涡旋振荡混匀。通入氮气挥去DCM之后，用HPLC分析。
1.4 体外药物释放实验 将适量载药微球混悬于10ml的磷酸盐缓冲液（PBS，PH7.4）中，其中还含有吐温80、吐温20和叠氮钠。将装有该混悬液的瓶子置于恒温37℃水平振摇，振摇幅度6cm，速度100r.min。在指定的时间点，将每批微球的3个样品取样，冷冻离心分离。将得到的微球重新用10ml新的介质混悬后，继续振摇。离心所得上清液，用上面描述的HPLC方法测定释放的药量。
1.5 微球的血液毒性评价
1.5.1 实验动物 18～20g雄性昆明鼠，购自军事医学院实验动物中心。定时投食，自由饮水。
1.5.2 给药方式及分组 每组6只小鼠，每组平均体重相差不超过1g。治疗组中分为载药微球组和市售紫杉醇注射液（Taxol）给药组，对照组为生理盐水注射组。微球组皮下注射，Taxol组和生理盐水组静脉给药。给药剂量Taxol的临床给药剂量，3组均为175mg.ml。
1.5.3 白细胞的测定 于给药前、给药后7、14、21、28d，分别将每只小鼠割尾静脉取血20μl，用Sysmex F-820半自动血细胞分析仪（日本东亚公司）测量每只动物的白细胞数。
1.6 紫杉醇缓释微球的体内抑瘤实验
1.6.1 实验动物及细胞 4～6周龄雄性裸鼠，购自军事医学科学院实验动物中心;前列腺PC-3M肿瘤细胞，购自北京大学医学部病理研究所。
1.6.2 动物分组及给药方式、剂量 每组7只裸鼠，每组平均体重相差不超过1g。治疗组中分为载药微球组和市售紫杉醇注射液（Taxol）给药组，对照组分为生理盐水注射组。微球组和生理盐水注射组均在瘤旁注射，Taxol组分别静脉注射和瘤旁注射。给药剂量参考Taxol的临床给药剂量，3组均为175mg.ml。
1.6.3 抑瘤率测定 待治疗10d后处死裸鼠，完整剥离皮下肿瘤移植物，称重，并按照下列公式抑瘤率。瘤重抑制率%=（1-T.C）x100%，（C为对照组平均瘤重，T为治疗组平均瘤重）。
1.7 统计学处理 数据经SAS6.12统计软件进行组间t检验。
2 结果
2.1 紫杉醇微球的处方筛选
2.1.1 PLGA分子量对包封率的影响 PLGA作为微球的主要骨架材料，其分子量直接影响到微球的包封率。PLGA分子量越高，其黏度随之提高，包封率也升高。
2.1.2 乳酸.羟基乙酸（LA.GA）不同比例对包封率的影响 相同分子量的PLGA由于其乳酸.羟基乙酸的比例不同而影响到微球的包封率。随着乳酸在PLGA中所占比例的增加，材料的疏水性增加，包封率升高。
2.2 优化工艺验证 采用改良的单乳溶剂蒸发法制备紫杉醇微球，包封率大于80%，所得微球平均粒径为2.6μm，粒子基本呈正态分布。外观圆整，表面分布零星空洞。
2.3.1 释放介质的选择 在释放介质中加入吐温80作为微球聚集抑制剂，加入吐温20作为湿润剂，对微球的体外释放有明显作用，结果显示在释放介质中同时加入两种表面活性剂，微球的释放曲线最佳。
2.3.2 释放容器的选择 在体外考察微球释放的实验中，所使用的容器对微球的释放行为有较为明显的影响。紫杉醇缓释微球若使用膜扩散技术的透析袋进行释放实验，微球基本无释放行为，但使用玻璃容器，微球的释药行为良好，而且对于玻璃容器没有形状上的特别要求。
2.3.3 最佳释放条件确定 经过对释放介质、释放容器及释放温度等因素的调节，确定了最佳的释放 条件，并以此释放条件重复3批样品的体外释放，结果显示体外释放速度平稳，释放时间为30d。
2.4 紫杉醇缓释微球的血液毒性评价实验 第14d Taxol组的白细胞数明显下降，而微球组自第7d有所下降后，呈持续平稳状态，结果显示紫杉醇微球对小鼠体内的白细胞没有明显杀伤作用，而紫杉醇注射液组对小鼠体内白细胞杀伤作用明显。
2.5 紫杉醇缓释微球的体内抑瘤实验 期间，用游标卡尺测量裸鼠体内肿瘤每天生长情况，待治疗20d后处死裸鼠抑瘤率。如表1所示，治疗20d后微球组的抑瘤率最高，经统计学计算，微球组抑瘤率与注射液皮下注射组有差异（P<0.05），与对照组有显著差异（P<0.01）。
表1 紫杉醇缓释微球的体内抑瘤实验结果（略）
注:*与生理盐水组相比，P<0.01;▲与Taxol皮下组相比，P<0.05
3 讨论
本研究中的紫杉醇长效缓释微球，是一种用生物可降解聚合物制成的缓释微球制剂，具有提高药物的溶解性、降低药物毒性、延长药物给药时间等特点。实验结果显示，该微球制剂对裸鼠体内的肿瘤有良好的抑制效果，且作用持久，并且明显减低了模型药物紫杉醇的血液毒性。其固体骨架材料PLGA是近年的研究热点，这种特殊的骨架材料通过降解溶蚀达到缓释药物的目的。同时由于该骨架材料可生物降解为水和CO 2 ，对人体无毒无害，已经被FDA批准为药用辅料。不同性质的药物制备微球时，根据不同需要可以选用不同分子量、不同LA.GA比例的PLGA。我们将抗肿瘤药物进行缓释剂型的改造，试图通过药物的缓慢释放来避免或降低不良反应，从而为抗肿瘤药物的临床应用提供新尝试。
【】
［1］Vaughn DJ，Brown AW Jr，Harker WG，etc.Multicenter Phase II study of estramustine phosphate plus weekly paclitaxel in patients with androgen-independent prostate carcinoma.Cancer，2004，100（4）:746-750.
［2］Smith DC，Chay CH，Dunn RL，Fardig J，Esper P，Olson K.Phase II trail of paclitaxel，estramustine，etoposide，and carboplatin in the treatment of patients with hormone-refractory prostate carcino- ma.Cancer，2003，98（2）:269-276.
