糖尿病大鼠心肌组织中Survivin蛋白表达的影响

                   作者：马计 张端莲 高凌 李培安

【摘要】  　　目的：研究糖尿病大鼠心肌组织中Survivin蛋白表达与糖尿病发病机制的研究。方法：按体重随机分为正常对照组(10只)和糖尿病组(20只) ,各组大鼠禁食12h 后,实验组大鼠以60mg/kg的剂量一次性腹腔注射链脲佐菌(streptozotocin,STZ)溶液,正常对照组大鼠(NC)注射等体积的枸橼酸盐缓冲液，观察动物饮水、进食及尿量变化等情况。一周后,采尾血测血糖,以血糖浓度> 16.6mmol/ L 、饮水量> 40 ml/ d 、尿糖强阳性的大鼠作为糖尿病大鼠，然后将各组大鼠处死,切取心室肌组织,进行免疫组织化学实验。结果：正常对照组心肌细胞胞浆内无棕黄色颗粒，Survivin蛋白呈阴性表达；糖尿病组心肌细胞胞浆内可见密集分布的棕黄色颗粒，Survivin蛋白表达呈强阳性。图像分析结果显示，正常对照组和糖尿病组平均光密度分别为0.0792±0.0034、0.2985±0.0152，正常对照组和糖尿病组阳性面积率分别为0.1083±0.0127、0.3469±0.0168。正常对照组与糖尿病组之间平均光密度及阳性面积率的差异有显著性意义(P<0.05)。结论：Survivin蛋白对心肌细胞凋亡起着重要作用。

【关键词】  糖尿病 心肌 Survivin蛋白 免疫组化

　　糖尿病(diabetes mellitus,DM)是一种多病因的代谢疾病，由于胰岛素分泌缺陷和（或）胰岛素作用缺陷从而引起糖、蛋白质、脂肪代谢异常，特点是慢性高血糖。高血糖得不到有效控制可能损害血管和神经，最终导致慢性并发症发生，如糖尿病视网膜病变、心血管病变、糖尿病肾病、糖尿病足、糖尿病神经病变和性功能障碍等。因此，糖尿病早期诊断和可以减少发生并发症的危险性。心肌细胞凋亡不仅由特定的基因调控, 还受细胞周围的刺激信号诱导或抑制, 外源性因子可通过一定途径发挥刺激效应。目前的研究表明, 影响心肌细胞凋亡的因素很多, 归纳起来, 主要有物理性、化学性以及生物性因素3大类, 这些因素中有生理性的或病理性的, 也有促发性的或抑制性的。存活素(suvrvini)是新近发现的AIP家族新成员，目前认为其可抑制凋亡信号传导通路的终末效应子caspase-3而发挥抗凋亡作用［1］。本研究采用免疫组织化学方法观察了高血糖引起的心肌细胞的凋亡作用，旨在讨论和寻找治疗糖尿病和保护心肌的实验依据。
 
　　1  材料与方法

　　1.1  材料
   
　　实验动物  昆明种SD大鼠30只,雄性,体重180～200g ,由武汉大学医学院实验动物中心提供,适应饲养1周后进行实验。

　　1.2  方法

　　1.2.1  动物模型建立及分组  按体重随机分为正常对照组(10只)和糖尿病组(20只) ,各组大鼠禁食12h 后,实验组大鼠以60mg/kg的剂量一次性腹腔注射　链脲佐菌(streptozotocin ,STZ)溶液(用0.1mol/ L、pH = 4.4 的构橼酸盐缓冲液在冰浴下配制成11mg/ml的STZ 溶液),正常对照组大鼠(NC)注射等体积的枸橼酸盐缓冲液，观察动物饮水、进食及尿量变化等情况。一周后,采尾血测血糖,以血糖浓度> 16.6mmol/ L ,饮水量> 40 ml/ d ,尿糖强阳性的大鼠作为糖尿病大鼠，然后将各组大鼠处死,切取心室肌组织,进行免疫组织化学实验。实验期间,密切观察动物进食和饮水量变化,每周称两次体重。

　　1.2.2  主要试剂  浓缩型兔抗鼠Survivin单克隆抗体盒(北京中山生物技术有限公司) ；超敏即用型S-P通用型免疫组织化学试剂盒(北京中山生物技术有限公司) ；显色试盒及多聚赖氨酸（北京中山生物技术有限公司）。

　　1.2.3  主要仪器  YWY781型医用微波仪（250 W，50 Hz），浙江临安器材厂生产；家用高压锅。

　　1.2.4  常规HE染色  以上各组动物实验完毕后,将各组动物从心底部剪取心脏,切下心室。4%多聚甲醛固定、包埋、石蜡切片、HE染色。

　　1.2.5  免疫组织化学S-P法检测Survivin蛋白相关抗原 
   
　　主要步骤：
   
　　① 组织切片5 μm，常规脱蜡至水，蒸馏水洗；
   
　　② 3%过氧化氢，37℃孵育10 min以抑制内源性过氧化物酶活性，PBS洗4×5min；
   
　　③ Survivin采用微波抗原修复（3档，10 min）， PBS洗4×5min；
   
　　④ 正常羊血清37℃孵育10 min以减少非特异性反应；
   
　　⑤ 一抗37℃孵育1h，PBS洗4×5min；
   
　　⑥ 生物素标记的二抗，37℃孵育10 min，PBS洗4×5min；
   
　　⑦ 链霉菌抗生物素蛋白-过氧化物酶复合物37℃孵育10 min，PBS洗4×5min；
   
　　⑧ DAB显色液显色，自来水冲洗终止反应；
   
　　⑨ 苏木精复染，脱水，透明，封片。
   
　　用PBS代替一抗作为阴性对照。

　　1.2.6  免疫组织化学结果判断 
   
　　Survivin蛋白以胞浆出现棕黄色颗粒为阳性反应。阴性对照除细胞核染成蓝色外，胞浆内无棕黄色反应物。
   
　　采用HPIAS-2000高清晰度彩色病理图文报告管理系统（同济千屏影像公司）对Survivin蛋白表达进行定量分析，每张切片随机选取5个完整而不重叠的高倍镜视野（×400），测定每个视野下阳性反应的平均光密度、阳性反应面积和所有细胞总面积，阳性面积率。以每例5个视野的平均光密度、阳性面积率的平均值作为该例的测量值。
   
　　（阳性面积率＝单位面积中阳性反应的总面积/单位面积中细胞的总面积×100％）

　　1.3  统计学处理
    
　　对各组免疫组织化学反应阳性颗粒的平均光密度、阳性面积率作单因素方差分析和SNK-q检验，检验水准α为0.05。

　　2  结果
   
　　正常对照组心肌细胞胞浆内无棕黄色颗粒，Survivin蛋白呈阴性表达；糖尿病组心肌细胞胞浆内可见密集分布的棕黄色颗粒，Survivin蛋白表达呈强阳性。图像分析结果显示，正常对照组和糖尿病组平均光密度分别为0.0792±0.0034、0.2985±0.0152，正常对照组和糖尿病组阳性面积率分别为0.1083±0.0127、0.3469±0.0168。正常对照组与糖尿病组之间平均光密度及阳性面积率的差异有显著性意义(P<0.05)，见表1。

　　表1  正常对照组与糖尿病组心肌细胞内Survivin表达的平均光密度和阳性面积率（略）

　　注：*   正常对照组与糖尿病组比较，P＜0.05。

　　3  讨论
   
　　糖尿病是目前临床学科中进展最迅速的学科之一。随着对糖尿病研究的不断深入,人们已逐渐认识到糖尿病的本质是血管病变。1999年,美国心脏学会提出,糖尿病是一种心血管疾病。目前,大血管病变是糖尿病患者死亡的主要原因,事实上,如果糖尿病没有血管并发症,糖尿病将不再是一个重大的公共健康难题。
   
　　在糖尿病大血管病变形成过程中,胰岛素抵抗、内皮功能紊乱和局部RAS激活等起重要作用。胰岛素抵抗在代谢综合征的形成中起重要作用,是心血管疾病(CVD)独立的预测因子。胰岛素抵抗可在2型糖尿病发生20～30年前就存在,在糖尿病发病前就可能对心血管系统造成不可逆损害。UKPDS研究证实,新诊断的2型糖尿病患者中有近50%出现了大血管并发症的临床证据。胰岛素抵抗的表型很多,除糖尿病外,还可导致高血压、慢性全身性疾病和内皮细胞功能紊乱等,并最终形成动脉粥样硬化。可以说,胰岛素抵抗是2型糖尿病与CVD的桥梁。RAS与糖尿病之间关系密切,糖尿病患者局部组织内RAS的激活和AT1受体对AngII的高敏感可能独立于系统RAS。内皮功能失衡是动脉粥样硬化的始动和核心环节,2型糖尿病在血管病变出现前数年就有内皮功能受损的标志物升高,而且内皮功能受损还常与胰岛素抵抗合并存在,两者相互协同,共同促进动脉粥样硬化的形成。代谢综合征包括的各种心血管危险因素均可引起内皮细胞功能紊乱,所以维护内皮细胞功能平衡,单纯依靠控制血糖远远不够,只有全面控制心血管危险因素,才能最终实现降低2型糖尿病心血管疾病发生率和死亡率的目的。
   
　　近年来,国内外许多学者经过临床和流行病学调查,以及周密设计的基础研究和实验研究,虽然对糖尿病的病因有了较多的认识,但对原发性糖尿病的病因仍然不清楚。有实验研究证明糖尿病性心肌病的特征性改变为间质改变和微血管改变。Karnafel发现糖尿病性心肌病的病理改变有微血管变窄、微动脉瘤形成、心肌肥大、胶原结构改变、心肌纤维化及血管周的纤维化。在糖尿病性心肌病中,心脏功能改变有心绞痛、心力衰竭和心律失常,左心室舒张功能障碍是糖尿病性心肌病的早期标志之一 。Cai等研究发现,高血糖可直接导致活体心肌细胞凋亡,高血糖导致的心肌细胞凋亡至少部分是通过细胞色素C 激活的caspase-3 途径的激活而控制。Cai等报道在糖尿病患者和动物模型中都可观察到心肌细胞死亡,通过抗氧化剂或凋亡信号途径的特异性抑制剂抑制心肌细胞死亡,可以明显的阻止糖尿病的心脏毒性,因此心肌细胞死亡在糖尿病性心肌病变中有重要作用。
   
　　Survivin 是凋亡蛋白抑制剂( Inhibitor of apoptotic protein, IAP) 家族的新成员［2～4］, 于1997年由耶鲁大学的Altieri 等应用效应细胞蛋白酶受体-1 (EPR-1) 的cDNA 通过杂交方法在人类基因组文库中筛选并鉴定出来, 是迄今克隆出的最小的IAP。它特异性地表达于胚胎发育组织及分化未成熟组织，并在几乎所有恶性肿瘤组织中出现高表达［5，6］, 而在正常成人组织中不表达(胸腺、胎盘、子宫内膜除外), 并且与肿瘤的发生、及预后密切相关［7～10］。
   
　　本研究结果显示，存活素在正常对照组心肌细胞内表达不明显，存活素在糖尿病组心肌细胞内表达较高。这一表达差异提示，糖尿病组细胞中存活素的过度活化可能与心肌细胞的凋亡密切相关，其可能通过阻断凋亡，破坏细胞增殖/凋亡平衡。

【】
  　　1 Temme A , R iegerM , Reber F, et al. Localization,dynamics, and function of survivin revealed by expression of functional survivinD sRed fusion proteins in the living cell. Mol Biol Cell, 2003，14(1)∶78.

　　2 Salvesen GS, Duckett CS. IAP proteins: blocking the road to deaths door. Nat Rev Mol cell Biol,2002，3 (4)∶401.

　　3 王诚, 冯一中, 顾永平. 人胰腺癌组织中凋亡抑制蛋白Survivin 的表达及其临床意义. 苏州大学学报(医学版),2004，24(4)∶515.

　　4 刘伟, 朱艳芳, 李敏. 应用组织芯片研究凋亡抑制基因Survivin 在胃癌中的表达. 临床消化病杂志,2005，17 (1)∶20.

　　5 Matsumoto G, Muta M , Umezawa K, etal.Enhancement of the caspase-independent apoptotic sensitivity of pancreatic cancer cells by DHM EQ, an NF-KappaB inhibitor. Int J Oncol,2005，27(5)∶1247.

　　6 刘江伟,李开宗,窦科峰,等. 胰腺癌组织survivin和COX-2表达的相关性. 第四军医大学学报,2004，25(7): 635～636.

　　7 Muzio LL, Staibano S, Pannone G, et al. Expression of the apoptosis inhibitior survivin in aggressive squamous cell carcinoma .ExpMol Pathol,2003，70:249～254.

　　8 Okada E, Murai Y, Matsui K, et al. Survivin expression in tumourcell nuclei is predicative of a favorable prognosis in gastric cancerpatients. Cancer Lett, 2003，163 (1):109～116.

　　9 Kennedy SM, Driscoll O, Purcell R, et al. Prognostic importance ofsurvivin in breast cancer. Br J Cancer, 2003，88: 1077～1083.

　　10 Cohen C, Lohmann CM, Cotsonis G, et al. Survivin expression invarian carcinoma: Correlatione with apoptotic marker and prognosis. Mod Pathol,2003，16(6): 574～583.