细胞周期素D1在甲状腺癌中的表达

                 作者：张旭艳 张端莲 喻小红

【摘要】  　　目的：探讨细胞周期素D1在甲状腺癌中的表达及临床意义。方法：收集武汉大学人民及武汉大学中南医院存档甲状腺癌蜡块40例，另取5例瘤旁组织为对照组。将甲状腺癌及瘤旁组织做免疫组织化学染色，观察各组细胞内细胞周期素D1表达的变化，利用HPIAS-2000图像分析系统测定细胞周期素D1在以上各组中表达的平均光密度和平均阳性面积率。结果：癌旁组织中无棕黄色颗粒，细胞周期素D1呈阴性表达；甲状腺癌组织内可见密集分布的棕黄色颗粒，细胞周期素D1表达呈强阳性。图像分析结果显示，癌旁组织和甲状腺癌组织中的平均光密度分别为0.0841±0.0045、0.2748±0.0256，癌旁组织和甲状腺癌组织中阳性面积率分别为0.1142±0.0113；0.3759±0.0153。癌旁组织和甲状腺癌组织中之间平均光密度及阳性面积率的差异有显著性意义(P<0.05)。结论：细胞周期素D1对甲状腺癌的发生、起了重要作用。

【关键词】  细胞周期素D1 甲状腺癌 免疫组化

　　甲状腺是人体重要的内分泌腺，它在机体新陈代谢方面具有重要地位，是内分泌系统中发病率最高的器官。甲状腺癌是常见的内分泌系统恶性肿瘤之一，约占全身恶性肿瘤的1.5%。与一般恶性肿瘤好发于老年人不同，甲状腺癌多发于青壮年，平均年龄约40岁，统计显示近年来甲状腺癌的发病率呈增高趋势［1～3］。分化型甲状腺癌占所有甲状腺癌的90% , 包括乳头状甲状腺癌(PTC)和滤泡状甲状腺癌( FTC)。甲状腺未分化癌较为少见, 但恶性程度高、预后差。近来研究发现,细胞周期调节失控是肿瘤发生的重要原因, cyclinD1是一种重要的细胞周期调节因子。真核细胞的增生及分化调节大部分发生于细胞周期的G0/G1期和G1/S期的转变期。cyclinD1在细胞周期关键限速点G1至S期转换中,通过激活CDK4或CDK6使后者催化一系列关键底物而导致转录因子释放,促进DNA合成而发挥加速细胞增殖的正性调节作用。本实验采用免疫组织化学方法检测了癌旁组织和甲状腺癌组织中细胞周期素D1的表达， 旨在探讨细胞周期素D1在甲状腺癌组织中所发挥的作用及机制，为进一步预防和甲状腺癌提供理论依据。
 
　　1  材料与方法

　　1.1  材料来源及分组
   
　　收集武汉大学人民医院及武汉大学中南医院存档甲状腺癌蜡块40例。男12例, 女28例，年龄23～68 岁。乳头状癌23例, 滤泡状癌14例, 未分化癌3例。按UICC 国际分期标准, I期12 例, II期15例, III期6例, IV 期7例。甲状腺癌组患者术前均未做放、化疗。另取5例瘤旁组织为对照组。

　　1.2  方法

　　1.2.1  主要试剂  浓缩型鼠抗人细胞周期素D1单克隆抗体 (北京中山生物技术有限公司) ；超敏即用型S-P通用型免疫组织化学试剂盒(北京中山生物技术有限公司) ；显色试盒及多聚赖氨酸（北京中山生物技术有限公司）。

　　1.2.2  主要仪器  YWY781型医用微波仪（250W，50 Hz），浙江临安器材厂生产；家用高压锅。

　　1.2.3  常规HE染色  4%多聚甲醛固定、包埋、石蜡切片、HE染色。

　　1.2.4  免疫组织化学S-P法检测细胞周期素D1相关抗原 
   
　　主要步骤：
   
　　① 组织切片5μm，常规脱蜡至水，蒸馏水洗；
   
　　② 3%过氧化氢，37℃孵育10 min以抑制内源性过氧化物酶活性，PBS洗4×5min；
   
　　③ 细胞周期素D1采用微波抗原修复（3档，10 min）， PBS洗4×5min；
   
　　④ 正常羊血清37℃孵育10 min以减少非特异性反应；
  
　　⑤ 一抗37℃孵育1h，PBS洗4×5min；
   
　　⑥ 生物素标记的二抗，37℃孵育10 min，PBS洗4×5min；
   
　　⑦ 链霉菌抗生物素蛋白-过氧化物酶复合物37℃孵育10 min，PBS洗4×5min；
   
　　⑧ DAB显色液显色，自来水冲洗终止反应；
   
　　⑨ 苏木精复染，脱水，透明，封片。
   
　　用PBS代替一抗作为阴性对照。

　　1.2.5  免疫组织化学结果判断 
   
　　细胞周期素D1以胞浆出现棕黄色颗粒为阳性反应。阴性对照除细胞核染成蓝色外，胞浆内无棕黄色反应物。
   
　　采用HPIAS-2000高清晰度彩色病理图文报告管理系统（同济千屏影像公司）对表达进行定量分析，每张切片随机选取5个完整而不重叠的高倍镜视野（×400），测定每个视野下阳性反应的平均光密度、阳性反应面积和所有细胞总面积，阳性面积率。以每例5个视野的平均光密度、阳性面积率的平均值作为该例的测量值。
   
　　（阳性面积率＝单位面积中阳性反应的总面积/单位面积中细胞的总面积×100％）

　　1.3  统计学处理 
   
　　对各组免疫组织化学反应阳性颗粒的平均光密度、阳性面积率作单因素方差分析和SNK-q检验，检验水准α为0.05。

　　2  结果
   
　　癌旁组织中无棕黄色颗粒，细胞周期素D1呈阴性表达；甲状腺癌组织内可见密集分布的棕黄色颗粒，细胞周期素D1表达呈强阳性。图像分析结果显示：癌旁组织和甲状腺癌组织中的平均光密度分别为0.0841±0.0045、0.2748±0.0256，癌旁组织和甲状腺癌组织中阳性面积率分别为0.1142±0.0113、0.3759±0.0153。癌旁组织和甲状腺癌组织中之间平均光密度及阳性面积率的差异有显著性意义(P<0.05)，见表1。

　　表1  癌旁组织与甲状腺癌组织内细胞周期素D1表达的平均光密度和阳性面积率（略）

　　注：*   癌旁组织与甲状腺癌比较，P＜0.05。

　　3  讨论
   
　　甲状腺癌仅占全身恶性肿瘤的1.5%左右，但却是最常见的内分泌系统恶性肿瘤。统计显示近年来甲状腺癌的发病率呈增高趋势。大多数甲状腺癌恶性低，预后良好。早期诊断和及时正确的是提高生存率的关键。 根据起源细胞的不同，可将甲状腺癌分为滤泡上皮细胞癌(乳头状癌、滤泡状癌及未分化癌)和滤泡旁细胞癌(即髓样癌)两大类。乳头状癌和滤泡状癌临床上常见，预后较好，两者又合称分化型甲状腺癌(DTC)［4］。未分化癌临床最少见，恶性程度高，患者5年生存率最低。髓样癌可分为家族型和散发型两种，因肿瘤结节可分泌降钙素、5-轻色胺、前列腺素、肾素和血管活性肠肤等活性物质，临床上患者可出现腹泻、心悸、头晕等表现。随着分子生物学技术的不断进步，发现甲状腺癌的发生、演化与其它肿瘤类似，均与癌基因和抑癌基因有关［5］。cyclin D1基因定位于染色体11q13 ,长度约120 kb,基因跨距约15 kb ,含有5个外显子,编码295个氨基酸构成的蛋白质,分子量为34kD。在细胞周期进程中,其含量受到生长因子等因素的调控,呈周期性变化［6～8］。cyclin D1可发生多种形式的基因突变,目前未发现明显地域性和种族性差异。cyclin D1的异常一般在鳞癌和腺癌较为常见,主要表现为:cyclin D1基因扩增、染色体易位及cyclin D1基因多态性的发生等。随着对cyclin D1 研究的不断深入,研究者们发现cyclin D1 不但与肿瘤的发生相关,而且与肿瘤的转移、预后也密切相关［9，10］。我们采用免疫组织化学方法观察了癌旁组织与甲状腺癌组织内细胞周期素D1表达，结果显示癌旁组织和甲状腺癌组织中细胞周期素D1的表达差异有显著性意义(P<0.05)。实验结果表明，细胞周期素D1在甲状腺癌组织内过表达，使细胞从CyclinD1向S 期的转变。CyclinD1 合成后与CDK4 ,6结合,形成CyclinD1-CDK4 或CyclinD1-CDK6复合物,并使CDK激活,该复合物磷酸化关键底物pRB ,使之释放出结合的转录因子E2 F ,促进DNA 转录,使细胞跨过G1/ S 关卡( G1/ S check point) ,促进细胞增殖，从而对肿瘤的发生及分化起了重要作用。

【】
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