邪毒壅盛证H22荷瘤小鼠肿瘤组织基因的表达特征研究
作者：卓少元 方肇勤 卢文丽 潘志强 梁超 吴中华 刘小美 侯俐 张辉 廖明娟 高必峰
【摘要】 目的揭示H22 荷瘤小鼠邪毒壅盛证肿瘤组织基因表达的特征。方法采用GeneChip Mouse Exon 1.0 ST Array等技术及芯片分析方法，观察H22荷瘤小鼠邪毒壅盛、早期气虚、中期阳气虚及中晚期气阴阳虚证肿瘤组织基因表达的差异。结果筛选到邪毒壅盛证独特性高表达的基因32个，其中包括Tcte3、Phf7、Ldhc等参与睾丸发育、精子或卵子发生的基因22个，Adipoq、Nrcam、Tnfaip6等与肿瘤有关的基因4个，以及Atp8b3、Pnpla3、Retn等其他功能的基因6个。筛选到邪毒壅盛证独特性低表达的基因2个，有Cort和LOC668417。结论邪毒壅盛证H22荷瘤小鼠肿瘤组织中存在大量独特性表达的基因，可能是该证候与其他证候区别的内在特征。
【关键词】 肿瘤； 证候； 同病异证； 邪毒壅盛证； 基因芯片； 小鼠
Abstract：ObjectiveTo investigate genes expression profile in tumor tissues of H22 mice with obstruction of evil syndromes. MethodsGenes expression in the tumor tissues of H22 mice with syndromes of obstruction of evil syndromes, “Qi” deficiency, deficiency of “Qi and Yang”, or deficiency of “Qi Yin and Yang”, were analyzed by Affymetrix GeneChip Mouse Exon 1.0 ST Array. Results32 special higher-expression genes were observed, including 22 genes which involve in testicle growth, spermatogenesis or oogenesis, 4 genes related to tumors, and 6 other gene. Simultaneously, 2 special lower-expression genes were observed. ConclusionNumerous genes have special expression in the tumor tissue of H22 mice with obstruction of evil syndromes, which may be intrinsic difference between this syndrome and 3 other syndromes.
Key words：Tumor; Syndrome; Different Syndrome for the same disease; Obstruction of Evil Syndromes; Genechip; Mice
“同病异证”和“同病异治”是中医理论的特色之一，其内在物质基础是什么，是长期以来被关注和研究的课题。本项目组以往的研究建立起H22荷瘤小鼠常见证候的标准化检测与辨证［1～4］，发现随着肿瘤的，荷瘤小鼠会自发形成证候并发生演变，早期以邪毒壅盛证和气虚证为主，以后发展为阳气虚证和气阴阳虚证，与人类十分相似［5，6］。为揭示“同病异证”物质基础，我们采用Affymetrix的GeneChip Mouse Exon 1.0 ST Array技术，对H22荷瘤小鼠邪毒壅盛证、气虚证、阳气虚证和气阴阳虚证4个常见证候的肿瘤、下丘脑、垂体、肾上腺等组织基因的表达进行了检测。本文重点探讨邪毒壅盛证H22荷瘤小鼠肿瘤组织基因表达的特征。现报道如下。
1 材料与方法
1.1 芯片检测数据的获取 采用项目组最近研究获得的4种常见证候荷瘤小鼠肿瘤组织的外显子芯片数据：昆明种小鼠［购自上海中医药大学动物实验中心，雄性，体重24 g～26 g，合格证号SCXK（沪）2003-0003，清洁级］，腋下接种H22肿瘤腹水癌细胞后，采用小鼠计量化四诊和辨证方法［1］，筛选出最典型的早期（接种后8 d）邪毒壅盛证和气虚证，中期（接种后21d）阳气虚证和中晚期（接种后29 d）气阴阳虚证荷瘤小鼠各16只，并分别提取4个不同证候小鼠肿瘤组织RNA，将各证候16个样本合并，采用Affymetrix GeneChip Mouse Exon 1.0 ST Array及其方法进行检测。外显子芯片的检测结果有两种输出方式：外显子和核心基因。本文取16661个核心基因进行初步分析［7］。
1.2 芯片数据的处理
1.2.1 相关基因的筛选条件 四张芯片中读数至少有一组芯片统计读数（以下简称读数）大于270的基因（该芯片读数均数，以排除那些表达过低者）；邪毒壅盛芯片读数与单纯气虚、阳气虚、气阴阳虚等3组比值，大于2.0或小于0.5的基因（视为上、下调的基因）。
1.2.2 相关基因信息的挖掘 利用互联网上最具代表性、权威性的生物医学数据库NCBI和清华同方全文数据库（CNKI）等，对符合筛选条件的相关基因进行文献信息挖掘和分析。
2 结果
在芯片的16661个基因中，至少有一组读数大于270的基因有6342个。其中，邪毒组与气虚、阳虚、阴虚3组相比，比值均大于2.0的基因有Tcte3、Vmd2、Mael、Atp8b3、Tuba3和Gstm5等32个，而比值均小于0.5的有cortistatin和LOC668417等2个基因。依据其参与的生物学功能大体上可以分为以下几类。
2.1 邪毒壅盛证肿瘤组织独特高表达的基因
2.1.1 参与睾丸发育、精子发生和成熟或卵子发生的基因 有Tcte3，Phf7，Ldhc，Vmd2，Mael，Fhl4，Tuba3等22个基因，这类基因在早期邪毒壅盛H22荷瘤小鼠肿瘤组织中的表达量都非常高，甚至个别基因芯片读数大于500（见表1）；在正常小鼠中，这类基因大多数在睾丸组织特异表达，还有少数基因虽在其它组织中也有表达，但以睾丸组织表达水平最高。如Tcte3，即T复合体相关睾丸表达3（t-complex-associated testis expressed 3）基因，它来源于小鼠T复合体区域、并在小鼠睾丸生殖细胞中特异性表达［8］，在小鼠睾丸中通过与活性很高的酪氨酸激酶2（Casein kinase 2，CK2）的β调节亚基特异性识别，参与细胞的转化和增殖［9］；而在很多组织中都有表达Phf7（PHD finger protein 7），在人类和小鼠睾丸组织（仅在支持细胞中表达）表达水平很高，主要参与精子发生的转录调节［10］；Ldhc基因编码蛋白乳酸脱氢酶C4（lactate dehydrogenase-C4， LDH-C4）是一种仅在哺乳动物睾丸中表达的代谢酶，基因核心启动子含有的GC盒（-70～-65）和CRE（cAMP应答元件，-53～-49，-39～-35）是其在睾丸中完全表达所必需的顺式作用元件［11］。
表1 邪毒壅盛证肿瘤组织独特性高表达的参与睾丸发育、精子发生等有关基因（略）
*部分功能给予详细介绍的重要基因
2.1.2 与肿瘤有关的基因 包括Adipoq、Nrcam、Tnfaip6 和Plcd4等4个基因（见表2）。这类基因的表达产物是细胞因子、黏附分子或酶类，不仅具有正常的生理功能，还与肿瘤有比较密切的关系。如脂联素（Adipoq）是脂肪细胞分泌的一种脂肪细胞因子，具有增加胰岛素敏感性、抗动脉粥样硬化、抑制炎症反应等作用，低脂联素水平可独立增加患子宫内膜癌、乳腺癌、胃癌和前列腺癌等的危险性，脂联素可能具有抗肿瘤活性［12］；Nrcam，即神经原相关细胞粘附分子（neuron-glia-CAM-related cell adhesion molecule），在人黑色素瘤和结肠癌细胞和组织中，是β-catenin/LEF-1信号途径的一个靶基因，其表达能促进细胞的迁移和肿瘤的发生［13］——可能是通过金属蛋白酶（metalloprotease）介导的NRCAM脱落的胞外区来实现的［14］；而肿瘤坏死因子α诱导蛋白6（Tnfaip6， tumor necrosis factor alpha induced protein 6），又名TSG6，在炎症损伤和卵巢排卵过程中表达上调，表现出抗炎活性、并在雌性生殖中起关键作用［15］，可作为前列腺癌或癌前期损伤诊断和预后的一个潜在靶标［16］；Plcd4（磷脂酶Cδ4）是G1/S期表达的早期基因之一，可能在细胞生长中起重要作用，Plcd4 mRNA在再生肝中的表达明显高于正常肝脏，并广泛分布于肿瘤细胞如肝细胞瘤（hepatoma）和src转染的细胞中［17］。
2.1.3 其他功能的基因 有6个，即Atp8b3，Pnpla3，Retn，LOC380907，Efhd1和Phyhipl。见表3。
表2 邪毒壅盛证肿瘤组织独特性高表达的与肿瘤有关的基因（略）
*部分功能给予详细介绍的重要基因
2.2 邪毒壅盛证肿瘤组织独特性低表达的基因 这类基因很少，仅有Cort和LOC668417两个（见表4）。其中，Cort的基因产物皮质抑素（cortistatin，CORT或CST），是一种在结构上与生长抑素（somatostatin， SRIF）非常相似的神经肽，可与所有已知的生长抑素受体结合，表现出神经元活性受抑等与SRIF共同的特性。但是，它也有许多与生长抑素不同的特性，例如与大脑皮层中乙酰胆碱的兴奋作用相拮抗诱导慢波睡眠、自发活动减少，以及对生长抑素没有反应的阳离子选择性电流的激活等。此外，CORT存在于人类内分泌胰腺，可能参与胰岛素和/或胰高血糖素水平的调节［18］。
表3 邪毒壅盛证肿瘤组织独特性高表达的其他类基因（略）
表4 邪毒壅盛证肿瘤组织独特性低表达的基因（略）
*部分功能给予详细介绍的重要基因
3 讨论
证候的形成有着复杂的物质基础，为此，采用基因芯片这样高效、大通量的检测手段十分必要。为了避免荷瘤小鼠个体的差异，我们采用了标准化的小鼠四诊检测与计量化的辨证方法，并将同一证候最典型的16 只小鼠肿瘤RNA样本合并，使芯片检测数据能够较客观地反映出各证候的集中趋势。
GeneChip Mouse Exon 1.0 ST Array含有16661个基因，面对如此多的基因，如何筛选那些可能具有重要病理意义的基因呢？基于功能重要的基因往往表达量大的生物学特点，我们取所有芯片读数均数270作为入选标准，在4个组别中一致小于该均数者放弃，希望能首先关注那些表达量较大者。
邪毒壅盛是H22荷瘤小鼠早期一个常见的证候，突出表现在肿瘤增长迅速、小鼠死亡率高、预后差，与同期的气虚证有很大的区别，是典型的同病异证［6，7］。是哪些基因表达的改变导致了这种证候的发生，并使得肿瘤增长如此迅速？通过对4张不同证候肿瘤芯片读数的分析，我们看到，与其他3种证候相比，在邪毒壅盛证荷瘤小鼠肿瘤组织独特性表达的34个基因中，有32个基因表达升高，其中竟有22个以往的研究发现与睾丸发育、精子发生和成熟或卵子发生等有关，这些基因不仅数目众多，而且表达量大。邪毒壅盛证H22荷瘤小鼠肿瘤组织有如此多的参与发育生殖的基因，这还是首次被观察到。通过检索我们还发现高表达基因中包括有细胞因子或粘附分子类基因，或多或少与各种肿瘤有着密切的关系，具有共性。这些基因在邪毒壅盛证小鼠肿瘤表达独特，很可能是该证候小鼠肿瘤快速增长、并导致该证候与其他证候差异的关键物质基础之一。该结果还提示，不论是邪毒壅盛证，还是其他证候，确实存在着独特性表达的基因，有可循，并可能是中医证候理论复杂内涵的一角。因此，本研究为进一步认识“同病异证”的物质基础以及我们今后深入的研究奠定了基础。
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