18β-甘草次酸抑制人结肠癌HT29细胞增殖的研究
【摘要】 目的观察18β-甘草次酸（18β-glycyrrhetinic acid,GA）对人结肠癌HT29细胞增殖的影响，并从细胞周期及细胞周期素依赖性激酶抑制蛋白（p16，p21，p27）表达丰度探讨可能的机制。方法以不同浓度的GA作用结肠癌HT29细胞后，噻唑蓝比色法（MTT）检测细胞增殖情况，流式细胞仪检测细胞周期，Western blot分别检测细胞周期素依赖性激酶抑制蛋白（p16，p21，p27）变化。结果GA作用HT29细胞后，增殖受到明显抑制。GA处理组细胞阻滞于G1/S期，并出现p16，p21，p27蛋白水平上调。结论GA可抑制人结肠癌细胞增殖，其机制与上调p16，p21，p27蛋白有关。
【关键词】 18β-甘草次酸 结肠肿瘤 细胞周期 p16 p21 p27
Abstract:ObjectiveTo observe the effects of 18β-glycyrrhetinic acid（GA）on proliferation, cell cycle and expression of CKIs of human colon carcinoma cell line HT29, and to investigate the mechanism of GA on colon cancer cell. MethodsAfter HT29 cells treated with varible dose of GA, we detectd the proliferation by MTT，and observed cell cycle by flow cytometer,and studied the protein level of CKIs (p16, p21, p27) with Western blot. ResultsGA could inhibit the proliferation of HT29 cell, and cause G1 phase arrest.The protein of p16,p21 and p27 of cancer cells treated with GA were up-regulated in dose- and time- dependent manner. ConclusionGA could inhibit proliferation and induce differentiation in human colon cancer cell line HT29 through up-regulating the expression of CKIs, especially p16,p21 and p27.
Key words:18β-glycyrrhetinic acid; Colon cancer; Cell cycle cyclin-dependent kinase inhibitors(CKIs); p16; p21; p27
18β-甘草次酸（18β-glycyrrhetinic acid,GA）是从中草药甘草中提取的有效成分。研究发现，GA对一些肿瘤细胞生长具有一定的抑制作用［1,2］。但是其抗癌机制尚不完全清楚。P16，p21，p27蛋白是细胞周期重要的调控因子，属于细胞周期素依赖性激酶抑制蛋白（cyclin-dependent kinase inhibitors，CKIs），对细胞周期具有负调控作用［3］。在多种肿瘤细胞系和实体瘤中都不同程度地存在CKIs表达失活的情况［4］。笔者以人结肠癌细胞HT29为模型，作用后，观察了GA对细胞增殖、细胞周期以及p16，p21，p27表达的变化情况，以探讨GA可能的作用机制。
1 材料与方法
1.1 材料人结肠癌细胞系HT29购自院上海生物化学和细胞生物学研究所，在37℃，5%CO2培养箱中培养，培养液为含10%小牛血清、100 U/ml青霉素和100 μg/ml链霉素的RPMI-1640（GIBCO BRL）。
1.2 MTT法检测细胞增殖GA，购自Sigma公司。取对数生长期的HT29细胞，调整细胞浓度为1×104/ml，按每孔0.1 ml接种于96孔细胞培养板中。无血清RPMI-1640同步化后，加入GA。设立空白对照组和不同GA作用浓度实验组，每组3复孔。培养72 h后进行MTT比色并绘制GA浓度与A570之间的关系曲线。细胞抑制率（%）=［（A对照-A实验）/（A对照）］×100%。
1.3 流式细胞仪检测细胞周期实验分组和GA处理同MTT检测。收集GA不同作用浓度的细胞，用预冷的PBS洗涤两次后加入70%乙醇1.0 ml固定细胞。上机前离心洗涤制成单细胞悬液，加PI（Sigma 公司）染色，暗室放置，用流式细胞仪检测细胞周期分布。
1.4 Western blot检测CKIs（p16，p21，p27）蛋白水平采用western blot检测p16，p21，p27蛋白水平，步骤参照［5］。主要蛋白抽提试剂NP-40，PMSF，Aprotinin 购自上海Sangon公司，BCA蛋白分析试剂盒购自PIERCE公司，鼠抗p16，p21，p27的单克隆抗体购自Santa Cruz公司，内参照兔抗β-actin多克隆抗体购自武汉博士德公司。分别收集GA不同作用浓度细胞的总蛋白，定量后进行Western blot，检测p16，p21，p27和内参照β-actin的蛋白表达水平并进行比较。
1.5 统计学处理所有数据资料均经SPSS10.0统计软件进行处理。P<0.05为差异具有统计学意义，P<0.01为差异性显著。
2 结果
2.1 GA对结肠癌细胞增殖的影响MTT分析显示，GA能抑制HT29细胞增殖，且呈剂量依赖性。结果见图1。
图1 GA对人结肠癌细胞HT29增殖的抑制作用（略）
2.2 GA对HT29细胞周期的影响GA作用48 h后，各个GA浓度作用组G1期细胞均明显多于空白对照组，而S期、M期细胞则相应减少。各GA剂量组之间差异性具有统计学意义（P<0.05）。见表1。提示GA能引起HT29细胞周期发生G0/G1期阻滞。
表1 GA对人结肠癌细胞HT29细胞周期的影响（略）
与对照组比较，*P<0.05;**P<0.01
2.3 GA对CKIs（p16，p21，p27）蛋白水平的影响Western blot检测发现，与空白对照组相比，GA处理组p16，p21，p27的积分光度值均有较明显的上升，差异均具有统计学意义（P<0.05）。提示GA能上调HT29细胞中p16，p21，p27蛋白的表达。结果见表2。
表2 GA对HT29细胞CKIs（p16，p21，p27）蛋白表达的影响（略）
与对照组比较，*P<0.05;**P<0.01
3 讨论
本研究采用不同浓度的GA处理结肠癌HT29细胞，于不同时间收集细胞，探讨了细胞增殖、细胞周期以及CKIs 重要成员p16，p21，p27表达。
MTT结果发现，GA可明显抑制HT29细胞生长，并且这种增殖抑制作用在一定范围内呈剂量依赖性效应，证实GA对结肠癌细胞生长有负调控作用。
细胞周期失控与肿瘤细胞分化有关。细胞分化的主要标志是合成特异性的功能蛋白，出现细胞类型的功能性改变，同时进行细胞表型的形态结构变化。这些标志性变化均在G1期及细胞分化期完成。肿瘤细胞去分化的一个重要特征就是G1-S期卡点失常，进入S期的细胞异常增多［6,7］。因此，G1期阻滞可看作细胞分化的一个判断指标。流式细胞仪检测结果发现，在GA抑制HT29细胞增殖的同时也可使其细胞周期的分布发生明显变化。GA作用48 h后，停滞于G0/G1期的细胞比例明显上升，而进入S期的细胞明显减少，且这种阻滞效应表现为一定程度上的剂量依赖性关系。本研究提示，GA对结肠癌细胞HT29的增殖抑制作用可能是由于GA改变了细胞周期的分布，使多数肿瘤细胞停滞于细胞分化期即G1期，阻止细胞向S期转化，从而减少了DNA合成和有丝分裂并促进其分化。
在此过程当中，CKIs在肿瘤分化中的的作用已引起人们的注意。p16，p21，p27是CKIs家族重要成员。其中p16属于INK家族，能特异性地抑制cylclin D/CDK2和cylclin D/CDK4复合物。而p21，p27都属于Cip/Kip家族，能广泛抑制cylclin D/CDK复合物的活性。它们可减弱cylclin D/CDK复合物对Rb蛋白的磷酸化作用，使细胞发生G1-S期阻滞，从而对细胞周期发挥负调控作用［8，9，10］。在多种肿瘤细胞系和实体瘤中都不同程度地存在CKIs表达失活的情况［4］。Western blot显示，人结肠癌细胞系HT29中3种CKIs蛋白p16，p21，p27都有表达。进一步发现，GA对p16，p21和p27表达均有不同程度的促进作用。其中GA对p21和p27表达促进作用较明显，且这种诱导作用呈剂量依赖性效应；对p16蛋白促进作用稍弱，但也呈剂量依赖性效应。
总之，本研究提示，GA可抑制癌细胞的恶性增殖，其机制可能与上调p16，p21，p27的表达有关。
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