卡托普利及合用氯沙坦对大鼠心肌梗死区早期重构影响的比较

                  作者：张晓霞，吴学思，韩志红，米树华

【摘要】  目的： 探讨急性心肌梗死（AMI）后早期联合应用卡托普利和氯沙坦对梗死区胶原沉积及梗死区扩张程度的影响及其机制. 方法： 56只雄性Wistar大鼠开胸结扎冠状动脉前降支建立AMI模型，术后24 h内随机分为模型组，卡托普利组，卡托普利＋氯沙坦组（合用组）. 卡托普利2 g/L溶于动物饮用水中，自由饮水；氯沙坦20 mg/（kg·d）灌胃. 14 d后经静脉注射100 g/L氯化钾使心脏舒张期停跳，中性甲醛恒压灌注并固定左心室，直接测量心室容积后制做左心室横截面病理切片. 行HE染色并用医学图像分析软件测定梗死面积、梗死区扩张指数；免疫组化方法测定梗死区I型胶原面密度、肌纤维细胞比例；每组另取6只大鼠以RT?PCR法测定梗死区Ⅰ, Ⅲ型胶原表达水平. 结果： 卡托普利或合用氯沙坦均显著降低梗死区扩张指数，但合用组梗死区扩张指数的改善劣于卡托普利组［(1.25±0.13 vs 1.12±0.14), P<0.05］；合用组梗死区I型胶原面密度有低于模型组的趋势［(11.8±2.6)％ vs （14.4±2.6)％］，而卡托普利组无明显减低；合用组梗死区肌纤维细胞比例明显低于卡托普利组［(59.2±5.1)% vs （70.8±8.5）%, P<0.05］，Ⅰ,Ⅲ 型胶原的表达低于卡托普利组，分别为［(0.720±0.210 vs 0.996±0.162)和(0.488±0.113 vs 0.660±0.098), P<0.05］. 结论： AMI后早期联合应用卡托普利和氯沙坦，可降低梗死区胶原沉积，对梗死区早期扩张的抑制作用弱于单用卡托普利.

【关键词】  大鼠；心肌梗死；左心室重塑；卡托普利；氯沙坦

     0引言

    血管紧张素转换酶抑制剂（angiotensin converting enzyme inhibitor，ACEI）和血管紧张素受体拮抗剂（angiotensin Ⅱ type 1 receptor blocker，ARB）均有效改善急性心肌梗死（acute myocardial infarction，AMI）后左心室重构. 但二者联合使用时并未进一步改善AMI患者的预后，甚至增加不良反应［1］. 基础研究也提示，二者合用对AMI大鼠左心室重构的改善作用不优于单用有效剂量的ACEI［2］. 这与ACEI联合ARB在慢性心衰中的有益结果［3］相矛盾. AMI后的左心室重构是包含了梗死区修复、扩张以及非梗死区肥厚、扩张变形的复杂过程. 我们拟通过观察在有效剂量卡托普利的基础上加用氯沙坦对心肌梗死区早期修复和扩张的影响，以探讨ACEI联合ARB对AMI后左心室重构的干预效果.

    1材料和方法

    1.1材料雄性wistar大鼠56只，体质量（240±20） g（北京维通利华实验动物中心）；卡托普利药粉（山东潍坊制药厂）；氯沙坦（美国默沙东公司）；α?actin mAb（美国LABVISION公司）；Ⅰ型胶原抗体及DAB显色试剂盒（武汉博士德生物工程公司）；Trizol，Taq酶，DTT（北京鼎国生物技术有限公司）；逆转录酶，RNasin（日本东洋坊生物公司）；dNTPs（Genview 公司）；彩色病理图像分析系统（北京航空航天大学）；PCR扩增仪（9600型，美国ABI公司）；Pclab?UE四导电生理仪及信号采集处理系统（北京微信斯达科技有限责任公司）.

    1.2方法

    1.2.1模型制作［3］100 g/L水合氯醛腹腔注射麻醉大鼠，经口气管插管，连接小动物呼吸机，左侧第四肋间横切口，在距主动脉根部2～3 mm处结扎前降支，结扎区域变苍白、搏动减弱以及Ⅱ导联ST段抬高为结扎成功.

    1.2.2动物分组和药物干预实验分为假手术组（n=8），卡托普利组（n=17），卡托普利+氯沙坦组（合用组，n=17），模型组（n=18）. 卡托普利以2 g/L浓度溶于动物饮水中，自由饮水；氯沙坦以20 mg/kg灌胃，每日晨1次. 共干预2 wk. 术后第5，10日尾套法测定各组大鼠血压.

    1.2.3血流动力学检测100 g/L水合氯醛腹腔注射麻醉大鼠，分离右颈动脉，插入颈动脉插管，并经换能器连接至生理分析仪，待动脉压力波形稳定后，选取6个压力周期波形，由分析系统自动主动脉收缩压(SBP)、舒张压(DBP). 继续将颈动脉插管推进到左心室，待心室内压力波形稳定后，选取6个心动周期，计算左室收缩压（LVSP)、左室舒张末压(LVEDP)和左室内压最大收缩和舒张速率(±dp/dt).

    1.2.4左心室容积测量及病理切片的制备静脉注入100 g/L氯化钾使心脏于舒张期停跳，迅速取出心脏，置于100 g/L冰氯化钾溶液中，使心脏舒张均一. 持续以100 g/L中性甲醛以13 mm水柱压力灌注左心室40 min，再将整个心脏浸入100 g/L中性甲醛固定12 h. 去除右心室、心房及大血管，用1 mL注射器直接测量心脏容积. 从心脏中部垂直于心脏长轴横切左心室，取心尖部分石蜡包埋，自心底部向心尖部每隔1 mm切取10 μm切片，行HE染色. 另在心脏中部切面切5 μm切片行免疫组化分析.

    1.2.5梗死面积和扩张指数测定［4］扫描左心室横截面切片，使用彩色病理图像分析系统测量各弧长、周长、面积和厚度. 按照公式梗死面积，以瘢痕弧长百分数表示. 梗死面积（%）＝瘢痕弧长/［(外周长+内周长)/2］×100%. 选扩张最明显的截面（中截面）测量扩张指数. 扩张指数=(左心室腔面积/左心室总面积)×(间隔厚度/瘢痕厚度).

    1.2.6免疫组化检测切片常规脱蜡，经30 g/L过氧化氢孵育10 min,山羊血清室温下孵育20 min后分别加入兔抗鼠Ⅰ型胶原抗体和α?actin mAb，4℃冰箱过夜,依次滴加羊抗兔IgG二抗，SABC液37℃孵育30 min，DAB显色试剂盒显色8 min,苏木素复染,脱水透明,中性树胶封片. 彩色病理图像分析系统进行分析. 统计分析中不包括血管自身胶原成分. 每张切片任意选5个视野进行统计分析,求得平均值.

    1.2.7RT?PCR检测梗死区Ⅰ,Ⅲ型胶原水平术后2 wk取心脏，分离梗死瘢痕区组织，使用Trizol(50～100 g/L组织)提取总RNA，反转录PCR法检测胶原a1(Ⅰ)和a1(Ⅲ)的表达，琼脂糖凝胶电泳后扫描DNA条带灰度，以collagenα1(Ⅰ)和collagenα1(Ⅲ)与GAPDH的比值作为半定量指标. collagenα1（Ⅰ）sense：5′?AAGAGGCGAGAGAGGTTTCC?3′; anti?sense: 5′?ATCACCAGGTTCACCTTTCG?3′；产物长度318 bp；collagenα1（Ⅲ）sense：5′?GCCTTCTACACCTGCTCCTG?3′; anti?sense: 5′?GATCCAGGATGTCCAGAGGA?3′；产物长度386 bp；GAPDH sense：5′?TGGAAAGCTGTGGCGTGATG?3′；anti?sense：5′?TCCACCACCCTGTTGCTGTAGC?3′，产物长度359 bp. 以HO?1与GAPDH的比值作为半定量指标.

    统计学处理：数据以x±s表示，使用SPSS11.5统计软件进行方差分析和t检验. P<0.05为差异具有统计学意义.

    2结果

    2.1血流动力学改变结果显示，假手术大鼠无明显心肌梗死，无死亡. 卡托普利组、合用组、模型组各存活12，12，11只大鼠，心肌梗死面积为35.6%～49.4％，各组大鼠心肌梗死面积差异无统计学意义（P>0.05）. 心肌梗死大鼠各血流动力学参数显著劣于假手术组. 卡托普利组与合用组血流动力学参数较模型组显著改善；合用组收缩压/舒张压低于卡托普利组，左心室舒张末压有较卡托普利组增高的趋势（P=0.08），左室内压最大收缩和舒张速率差异无统计学意义（P>0.05，表1）.表1合用卡托普利和氯沙坦与单用卡托普利对AMI大鼠血流动力学影响的比较（x±s）组别〖〗n〖〗梗死面积（％）〖〗无创BP（mmHg）〖〗SBP（mmHg）〖〗DBP（mmHg）〖〗LVEDP（mmHg）〖〗dp/dt（mmHg/s）〖〗-dp/dt

    2.2心脏容积与梗死区扩张指数心脏容积卡托普利组，合用组与模型组相比较均明显小于模型组，分别为［（1.75±0.17 vs 1.92±0.18），（1.76±0.15 vs 1.92±0.18） ，P<0.05］，但卡托普利组与模型组组间心脏容积无显著性差异［(1.75±0.17 vs 1.76±0.15), P=0.87］. 卡托普利组与合用组梗死区扩张指数均小于模型组［(1.12±0.14 vs 1.53±0.33），（1.25±0.13 vs 1.53±0.33), P<0.05］，而合用组大于卡托普利组［（1.12±0.14 vs 1.25±0.13）, P<0.05，图1］.

    2.3Ⅰ型胶原面密度与肌纤维细胞比例合用组梗死区I型胶原面密度有低于模型组的趋势［（11.8±2.6  vs 14.4±2.6）, P=0.07］；而卡托普利组无明显减低［（12.8±3.2 vs 14.4±2.6）, P=0.36］. 成纤维细胞中肌纤维细胞的比例合用组明显低于卡托普利组［（59.2±5.1 vs 70.8±8.5）, P<0.05］和模型组［（59.2±5.1 vs 72.3±7.3）, P<0.01］，而卡托普利组较模型组无明显减低［（70.8±8.5 vs 72.3±7.3），P=0.75，图2，3］.

    2.4合用组及卡托普利组梗死区Ⅰ,Ⅲ型胶原的表达梗死区Ⅰ,Ⅲ型胶原α1链的表达合用组低于卡托普利组，分别为［（0.720±0.210 vs 0.996±0.162），（0.488±0.113 vs 0.660±0.098），P<0.05，图4］.

    3讨论

    本实验发现，单用卡托普利或同时应用氯沙坦均可有效改善心肌梗死后2 wk梗死区和整个左心室的重构，但单用卡托普利时梗死区扩张指数小于两药合用时. 扩张指数用于描述梗死区扩张的程序［4］，因此，提示单用卡托普利对梗死区较早期重构的改善作用优于与氯沙坦合用. 并且，卡托普利组LVEDP也有低于合用组的趋势（P=0.08），单用卡托普利对AMI后较早期左心室功能的改善优于与氯沙坦合用. 瘢痕愈合的速度和强度是影响梗死区扩张程度的重要因素之一. 研究［5］发现，合用卡托普利和氯沙坦时梗死区羟脯氨酸浓度低于单用卡托普利. 本实验发现，与模型组相比较，卡托普利组梗死区Ⅰ型胶原面密度无显著减低，而合用组却有减低趋势（P=0.07），提示合用卡托普利和氯沙坦时梗死区Ⅰ型胶原沉积可能延缓. 由于Ⅰ型胶原为粗纤维，抗张力作用强，梗死区胶原尤其Ⅰ型胶原沉积的延缓可能与合用组梗死区扩张程度大于卡托普利组有关.

    本实验还发现，合用组梗死区被α?actin标记的成纤维细胞比例明显低于卡托普利组，提示肌纤维细胞的转化和增殖受到更强抑制，并且合用组Ⅰ，Ⅲ型胶原的表达低于卡托普利组，提示肌纤维细胞的胶原合成也受到更强抑制，这些可能均与胶原沉积的延缓相关. AMI后，首先发生梗死区扩张，继而引起边缘带变形、远隔区域室壁弧度改变和室壁张力增加，并一直持续到梗死区胶原瘢痕强度足以有效平衡扩张张力［6］. 因此，梗死区扩张程度直接影响了整个左心室的晚期重构. 合用组这种早期的相对劣势可能是其未能较单用ACEI或ARB进一步改善AMI预后的原因.

    综上所述，AMI早期不宜合用大剂量卡托普利和氯沙坦，合用的恰当时机尚需进一步实验研究.

【】
  ［1］ Pfeffer MA, McMurray JJ, Velazquez EJ, et al. Valsartan, captopril, or both in myocardial infarction complicated by heart failure, left ventricular dysfunction, or both［J］. N Engl J Med, 2003, 349(20): 1893-1906.

［2］ Sugie T, Kagaya Y, Takeda M, et al. Should increasing the dose or adding an AT1 receptor blocker follow a relatively low dose of ACE inhibitor initiated in acute myocardial infarction? ［J］. Cardiovasc Res, 2003,58(3):611-620.

［3］ McMurray JJ, Ostergren J, Swedberg K, et al. Effects of candesartan in patients with chronic heart failure and reduced left?ventricular systolic function taking angiotensin?converting?enzyme inhibitors: The CHARM?Added trial［J］. Lancet, 2003,362(9386):767-771.

［4］ Fraccarollo D, Galuppo P, Bauersachs J, et al. Collagen accumulation after myocardial infarction: Effects of ETA receptor blockade and implications for early remodeling［J］. Cardiovasc Res, 2002,54:559-567.

［5］ 张晓霞，吴学思，姚海木，等. 合用卡托普利和氯沙坦对大鼠急性心肌梗死后梗死区胶原修复及早期左心室重构的影响［J］. 心肺血管病杂志, 2006,25:111-113.

［6］ Pfeffer MA, Braunwald E. Ventricular remodeling after myocardial infarction, experimental observations and clinical implications［J］. Circulation,1990,81:1161-1172.