贫铀长期植入对大鼠肾脏损伤效应的研究

【摘要】  目的 研究贫铀植入后不同时相点对大鼠肾脏的损伤效应。方法 采用初成年健康雄性Wistar大鼠分别植入贫铀片，观察大鼠接触贫铀后3、6、12、18月其肾脏超微结构和病理形态学改变,肾功能检测和胶原染色，并采用免疫荧光和蛋白印记杂交检测肾脏不同时间段纤维化相关因子TGF-β 1与Smad表达。结果 植入贫铀后不同时间段大鼠肾脏出现不同程度的病理改变，表现为肾小球固缩、后继肾小管萎缩和局部肾间质纤维组织增生以及炎性细胞浸润。纤维化程度随接触时间延长而加重。胶原染色显示胶原分布主要位于肾小管周围，且具有区域性。TGF-β 1与Smad是肾脏组织纤维化进程中重要的细胞因子。Western Blot分析显示贫铀接触后大鼠肾脏中TGF-β 1与Smad均有不同程度的增加。结论 贫铀长时间植入后大鼠肾脏可出现病及超微结构的改变，TGF-β 1与Smad参予了其纤维化进程。

【关键词】  贫铀 肾脏 纤维化 毒性

    Abstract：Objective To study the toxic effects on rat kidney after long term depleted uranium(DU)exposure.Methods Twenty adult male rats were implanted DU plates as implanted group.The morphology changes of kidneys were observed by electronmicroscopy and microscopy after 3,6,12,18 months exposure.Fibrosis-correlated cytokines such as TGF-β1 and Smad were analyzed by immunofluorescence and Western Blotting.Kidney function and collagen staining were also fulfilled.Results At different time-point,the morphological structure observation showed that DU exposure can cause the kidney fibrosis among which glomerulus pyknosis,tubule atrophy and regional renal interstitial fibrosis.The fibrosis became aggravated with longer exposure.The analysis and collagen staining showed that these cytokines and collagen distribution primarily located on periphery of nephric tubule,and seldom on glomerulus if any.TGF-β1 and Smad are important factors for tissue fibrosis. Western Blot analysis showed that Transforming Growth Factor beta 1(TGF-β1) and Smad in kidney all increased after DU exposure.Conclusion After long term DU exposure,the rats kidneys showed morphology and ultrastructure changes at different levels.TGF-β1 and Smad both took part in the process of fibrosis.

    Key words:depleted uranium；kidney；fibrosis；toxicity

    贫铀(Depleted Uranium，DU)是铀原料经浓缩提取235U以后所产生的副产品，因其235U含量低于天然铀故而得名。目前DU合金被广泛应用于各类民用和军事项目。贫铀既具有放射毒性，又具有化学毒性，由于其高传能线密度，特定组织器官蓄积以及半衰期长的特点，人员因嵌入、吸入或食入贫铀后，会对人体产生严重损害作用。损害作用与接触的剂量、时间以及接触者的年龄、性别、体质、饮食等有关［１］。肾脏是铀的主要蓄积器官和排泄器官，进入机体的铀绝大部分进入肾脏并通过尿液排出体外，因此，肾脏在铀对机体的毒性危害中占重要地位。铀染毒后可引起典型的急性肾功能衰竭。肾脏纤维化与慢性肾功能衰竭的进展关系十分密切，几乎所有的慢性进行性肾脏疾病都是肾纤维化破坏过程的结果。因此，本研究拟通过大鼠长期低剂量接触贫铀，检测肾脏功能，肾脏的超微结构和组织病理形态学观察，胶原染色，Western Blot分析以及免疫组化检测。研究贫铀对大鼠肾脏可能存在的损伤效应，以TGF-β 1为代表的组织纤维化相关细胞因子在肾纤维化进程中所起的作用，对贫铀可能引起的肾脏损伤及其机理进行初步研究。

    1  材料与方法

    1.1  DU植入模型的建立

    采用初成年雄性Wistar大鼠，体质量为150～200 g，20只，右后肢贫铀片植入，DU片组成、大小及植入方法见［2］。对照组大鼠20只，除植入物为与贫铀片相同体积的塑料片外，其他与植入组相同。本研究所采用大鼠均由第三军医大学大坪动物研究所提供。

    1.2  病理组织学与超微结构观察

    在大鼠植入贫铀3、6、12和18个月后，处死大鼠，取肾脏组织分别用多聚甲醛及2％戊二醛溶液固定后包埋，进行病理形态学和超微结构观察。

    1.3  大鼠肾功能检测

    检测大鼠血液中尿素(UREA)、肌酐(CREA)以及Na＋、K＋、Cl-等离子的浓度。

    1.4  胶原含量分析

    肾组织石蜡切片，苦味酸Sirus Red染色：切片脱蜡至水，蒸馏水洗 2 次，苦味酸Sirus Red染液浸染,苏木素复染，盐酸酒精溶液分化，梯度酒精脱水，二甲苯透明，中性树胶封片。

    1.5  TGF-β 1和Smad的Western－Blot蛋白印迹分析    剪取肾组织约100 mg，加入组织裂解液，提取肾组织总蛋白，并进行蛋白浓度测定。SDS-PAGE电泳，PVDF膜半干式转印，封闭液4℃浸泡过夜。分别以1∶200稀释的一抗、1∶500稀释的辣根过氧化物酶标记的相应二抗孵育。DAB显色，凝胶成像分析系统分析处理。

    1.6  TGF-β 1和Smad的免疫组化染色

    按照博士德免疫组化试剂盒操作说明进行。

    1.7  统计学处理

    数据分析采用Microsoft Excel和Spss软件进行统计学处理。

    2  结果

    2.1  病理组织学与超微结构观察

    植入组大鼠肾脏在贫铀接触 3 个月后可见部分肾小球纤维化，肾小管萎缩或扩张；6个月后表现出不同程度的肾小球固缩硬化，部分肾小球则代偿性肥大，肾包膜部分皱褶；12个月后，见灶性多个肾小球萎缩，在皮髓交界处肾单位破坏严重，可见囊状坏死软化灶及炎细胞浸润，间质纤维化，部分残留肾单位肥大。18个月后可见肾实质灶性纤维化，部分肾小球肥大，间质少量炎细胞浸润。

    超微结构观察：3个月后，肾小球毛细血管内皮细胞增生，形态异常，管腔狭窄闭塞，基底膜皱褶，未见沉积物，足细胞内吞噬溶酶体增多，系膜细胞明显增生。间质中纤维母细胞增生明显，核不规则，吞噬细胞内可见致密颗粒。近端肾小管内上皮细胞含有大量吞噬颗粒。远端肾小管上皮细胞中有很多溶酶体。间质中多见吞噬细胞，胞浆内可见致密颗粒。6个月后，肾小球系膜显增生，胞浆内有致密颗粒沉积，肾小球毛细血管未见明显异常，仅见局灶性足突融合，基底膜增厚，并有致密物沉积，球囊腔可见许多蛋白性漏出物。肾小管或肥大或萎缩，胞浆内聚集许多溶酶体。萎缩的肾小管基底膜皱褶，管腔塌陷。12个月后，肾小球毛细血管腔塌陷，基底膜皱褶成团，管腔内有血小板及血栓形成，球囊上皮增生变厚。肾小管内皮细胞坏死破碎，管腔塌陷，间质大段纤维化，保留下的肾小管则结构完好。肥大的肾小球，内皮细胞和足细胞胞浆内有较多吞噬溶酶体和致密颗粒。18个月后，超微结构与12个月大致相同。

    2.2  贫铀接触后各组大鼠肾脏功能的变化

    在植入组大鼠，血液中的尿素、肌酐以及Na＋、K＋、Cl-等离子在接触贫铀后并没有明显的增加或减少(见表１)。

    2.3  胶原染色

    对各组大鼠肾脏不同时相点石蜡切片进行胶原染色，经天狼星红染色，偏振光显微镜下可见Ⅰ型胶原显示很强的双折光性，为红色或黄色的纤维，Ⅲ型胶原显示为弱的双折光性，为绿色纤维。实验组大鼠肾脏中肾小管部分区域以及小动脉周围胶原染色呈阳性，染色强度及染色区域均高于对照组，随接触时间的延长染色强度和染色区域均增加，且多为Ⅰ型胶原。对照组胶原染色未见明显染色阳性区域，折光强度弱，呈弥散性分布，但随大鼠年龄增加染色逐渐加深。18个月后贫轴组大鼠肾脏与对照组比较胶原染色呈强阳性，染色区域多，折光强度高。 表1  植入组大鼠肾脏功能的变化

    2.4  TGF-β 1和Smad的Western-Blot免疫印迹分析    大鼠接触贫铀后Western Blot结果显示TGF-β 1和Smad的表达在接触贫铀后均有所增加，高于对照组1、6、18个月的蛋白量。但实验组各个时相点间未见明显增加或减少(见表2)。表2  贫铀对植入组大鼠肾脏纤维化相关细胞因子表达的影响

    2.5  免疫组化检测各细胞因子在肾脏中的表达

    对TGF-β1和Smad在肾脏组织中的表达进行DAB染色，以及SABC和FITC染色验证，发现在贫铀接触后大鼠肾脏中TGF-β 1和Smad、的表达均增加，染色阳性部位主要集中于肾小管周围，且具有区域性。各个细胞因子在肾小球表达阴性或弱阳性。

    3  讨论

    肾脏是铀的主要蓄积器官以及排泄器官，机体接触铀后，进入机体的铀绝大部分进入肾脏并通过尿液排出体外。通过肾功能检测、肾脏的病理组织学及超微结构观察可对贫铀引起的毒性损伤进行客观评价。本研究中Na＋、K＋、Cl-三者含量在贫铀作用后基本保持稳定，说明大鼠肾脏近曲小管的代偿功能完好。肌酐和尿素氮未见明显增加，表明肾脏的耐受性提高以及代偿能力恢复维持肾功能正常。可以认为贫铀长期接触可对大鼠肾脏产生损伤效应，同时因肾脏的代偿和耐受作用而产生轻微的或不可查的症状及表现。

    植入组肾脏的病理组织学结构发生改变，但代偿增生的肾单位则结构尚完整。这也是前面所述肾脏功能完好的物质基础。超微结构观察可见贫铀引起肾脏足细胞破碎、坏死、足突融合，胞浆内可见致密颗粒沉积。足细胞损伤缺失后不能再生，失去了足细胞支撑的基底膜就会在毛细血管静水压的作用下，受压凸向肾小囊，超微结构观察就可发现基底膜皱褶。皱褶的基底膜进而与肾小球壁层上皮细胞粘连，造成细胞增生、损伤和细胞外基质成分的沉积，最终形成肾小球硬化。超微结构观察还显示了除足细胞外，巨噬细胞、肾小管上皮细胞和成纤维细胞都参与了肾脏对贫铀的摄取或出现不同程度损伤。机体对贫铀的摄取与吞噬细胞的吞噬功能密不可分，巨噬细胞随时间延长摄入贫铀量不断增加［3］。激活的巨噬细胞能分泌不同的炎性因子，从而参与脏器组织的纤维化进程。

    肾小管间质纤维化（Tubulointerstitial Fibrosis,TIF）以肾小管损伤、肾间质单核细胞浸润、肾间质纤维化为特点，它是最终导致慢性肾功能衰竭的主要病理基础。本研究中胶原染色和病理形态学观察均发现大鼠肾纤维化的主要部位在肾小管周围，可见肾小管损伤是TIF的主要启动因素［4］。同时肾间质纤维化位于肾小管周围，而肾小管上皮细胞超微结构显示贫铀沉积，并可见成纤维细胞的大量聚积，说明肾小管上皮细胞在贫铀所致大鼠肾纤维化进程中具有重要致病作用。

    TGF-β 1一直被认为是肾纤维化的重要靶点。肾固有细胞及炎细胞如巨噬细胞等均可分泌TGF-β 1，可以自分泌的方式作用于自身，又可以旁分泌的方式作用于间质的成纤维细胞，促其增殖并大量产生细胞外基质。在肾间质纤维化的进程中，TGF-β 1的过度表达刺激胶原蛋白和蛋白聚糖的表达；抑制胶原酶、TIMPs的活性，从而抑制细胞外基质的降解；刺激成纤维细胞增生并具有趋化作用；刺激肾小管上皮细胞转分化为肌成纤维细胞等［5，6］。TGF-β 1主要表达在纤维增生的间质、受损伤的肾小管上皮细胞及肾小球内。肾系膜细胞可表达Smad 1，2，3，4，7.经TGF-β 1刺激后即可出现Smad 2和Smad 3的磷酸化，并伴有Smad 2，3，4复合体的形成。结合的Smad蛋白转运到细胞核内，它们与另外一些转录因子相互作用或相互激活，调节靶基因的转录。激活的转录因子（c-myc，fos等）可引起肾小管上皮细胞的增殖及I型胶原的表达［7］。TGF-β 1大多数致纤维化途径是通过Smad介导的。经Western Blot分析可见经贫铀暴露所致的大鼠肾脏其表达TGF-β 1和Smad均增加，且两者的免疫组化染色均定位于肾小管间质发生纤维化部位。在代偿增生的肾小管附近则呈弱阳性或阴性表达。说明TGF-β 1和Smad均参与了贫铀所致大鼠肾纤维化进程。

    虽然本研究未发现贫铀对大鼠肾脏功能有明显的损伤效应，但胶原染色、病理组织学改变及超微结构观察均证实了贫铀对肾脏的毒性作用。TGF-β 1和Smad参与了贫铀导致的大鼠肾脏纤维化进程。

【】
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