杆状病毒转导的小鼠羊水干细胞保持成骨分化潜能的实验研究
【摘要】 目的 探讨带有绿色荧光蛋白基因的重组杆状病毒修饰后的小鼠羊水干细胞(mouse amniotic fluid stem cells, mAFSs)是否仍保持成骨分化潜能。方法 体外原代培养小鼠羊水干细胞，并进行成脂成骨诱导分化，鉴定多向分化潜能；体外构建并扩增重组杆状病毒（Baculovirus-CMV-GFP, Bv-GFP）；Bv-GFP体外转导小鼠羊水干细胞，流式细胞仪检测其转导效率；经Bv-GFP基因修饰后的小鼠羊水干细胞进行成骨诱导分化。结果 小鼠羊水干细胞体外具有良好的增殖能力，3代后的细胞呈现较均一的梭形、漩涡状生长，且小鼠羊水干细胞体外具有成脂成骨分化潜能。体外成功构建重组杆状病毒，经Sf9细胞扩增后，极度稀释法测定其滴度可达109v.g/ml；Bv-GFP体外可较有效转导小鼠羊水干细胞，其转导效率为52.85％，且经Bv-GFP基因修饰后的小鼠羊水干细胞仍保持成骨分化潜能。结论 小鼠羊水来源干细胞是一种理想的干细胞，杆状病毒是一种新型病毒基因载体，体外能较有效转导小鼠羊水干细胞且不改变其成骨分化潜能。经重组杆状病毒基因修饰的羊水干细胞会为今后的骨组织工程提供一种新的模式。
【关键词】 杆状病毒 羊水细胞 基因修饰 成骨分化
【Abstract】 Objective To explore whether the mouse amniotic fluid stem cells(mAFSs) maintain the potential of osteogenesis differentiation after gene modification by green fluorescent protein(GFP) labeled baculovirus. Methods mAFSs were primary cultured in vitro and were induced for osteogenic and adipogenic differentiation, the multi-directional differentiation was identified. Baculovirus-CMV-GFP(Bv-GFP) was constructed and amplified, then it was transfected to mAFSs, the transfection efficiency was tested by flow cytometer; osteogenic differentiation was induced on the transfected stem cells. Results The mAFSs had good proliferation capacity, cells were homogeneously spindle-shaped after 3 generations and grew in whirlpool manner, also they had osteogenic and adipogenic differentiation potential. The reconstructed baculovirus was successfully constructed, after Sf9 amplification, the tilter was 109v.g/ml after extreme dilution method；Bv-GFP could effectively transfected mAFSs, with the transfecting rate at 52.85%, and remained osteogenic and differentiation potential after gene modification. Conclusions mAFSs are ideal stem cells, baculovirus is a new type of viral genetic vector, which can effectively transfect mAFSs without changing the osteogenic differentiation potential. MAFSs, after genetically modified by reconstructed baculovirus, provides a new treating mode for bone tissue engineering.
【Key words】 Baculovirus Amniotic fluid stem cell Gene modification Differentiation of osteogenesis 外伤或手术时造成的骨损伤如不能自行修复，则会造成骨不愈合或骨缺损,常需自体或异体骨移植，但其效果并不确切,不但增加了病人的痛苦和负担，同时又存在许多并发症［1］。若在骨损伤的部位注入有成骨潜能的细胞并诱导其成骨分化，可能解决这一问题［1，2］。干细胞的发现和深入研究为这个设想带来了希望。干细胞是具有自我复制和多向分化潜能的一类细胞，一般分为胚胎干细胞和成体干细胞。常见的成体干细胞如骨髓间充质干细胞、脂肪干细胞、脐血干细胞等，虽然大量的研究证实它们可以于体内外成骨分化［2］，但取材较困难，且成骨分化潜能较低［2，3］；胚胎干细胞虽然具有较好地成骨分化潜能，但因其受伦理道德的限制及体内具有致瘤可能性，应用受限［4，5］。最近的大量研究表明，羊水中亦存在干细胞，在体内外具有很好的增殖能力［6～8］，它具有胚胎干细胞的特性，如表达SSEA、OCT-4等胚胎干细胞表面标志［6～9］，同时羊水干细胞于体内外都具有较好的成骨分化潜能［6～8］，且其取材容易，无伦理道德限制，故对于骨组织的修复研究来说，羊水干细胞是一种理想的种子细胞［10］。然而，干细胞在体内成骨分化受到多种因素的影响［11］，若在体外对干细胞进行基因修饰，将会显著提高其在体内的成骨分化潜能［11］。目前，常用的基因载体如腺病毒载体、慢病毒载体、质粒载体有诸多缺陷而限制了的临床应用［12］。而杆状病毒包装载体容量大，对靶细胞无毒性作用，无致瘤性等优点［13］，是一种理想的病毒基因载体，但重组杆状病毒是否可有效转导羊水干细胞，以及转导后的羊水干细胞是否保持成骨分化潜能，目前国内外还没有相关报道。本研究旨在探讨体外Bv-GFP是否可有效转导小鼠羊水干细胞，以及对其成骨分化是否有影响，为今后的杆状病毒载体基因修饰羊水干细胞及运用于今后的骨组织重建工程研究奠定基础。
1 材料和方法
1.1 主要试剂及器材 低糖DMEM培养基（L-DMEM）、Grace培养基、胎牛血清(Fetal bovine serum, FBS)、马血清、无钙镁PBS、碱性成纤维细胞生长因子（bFGF），均购于美国Gibco公司；维生素C、β-磷酸甘油，购于美国Sigma公司，培养瓶、离心试管及培养皿，购于美国Corning公司；倒置荧光显微镜为日本Olympus产品，流式细胞仪为美国BD公司产品。
1.2 实验过程 （1）将2月龄昆明小鼠雌雄合笼，如第2天发现雌鼠阴部有白栓，即开始计时。取孕12d的小鼠，在水合氯醛麻醉下，剖开腹部，用微量定量注射器在羊膜内取0.3ml左右的羊水，注入3.5cm的培养皿中,并加入含有10%FBS、10ng ml-1bFGF、100U ml-1青霉素和100μg ml-1链霉素的2ml低糖DMEM冲悬混匀。2d后换液，可见有梭形贴壁细胞出现。12d左右后，培养皿中贴壁的梭形细胞可长至80％以上。吸去培养基，用PBS洗2遍之后，加0.25％的胰酶消化，以1∶2传代并细胞计数。以后每2d换一次液，细胞长至90％时，以1∶3传代。(2)P5代小鼠羊水干细胞传于培养皿中，待其长至80％以后，吸去完全培养基，用PBS洗2遍之后加入2ml成脂、成骨诱导液。成脂诱导液：低糖DMEM加入终浓度为10％胎牛血清、50μg/ml维生素C、10-7mmol/L地塞米松、50μg/ml吲哚美辛。成骨诱导液：低糖DMEM加入终浓度为10％胎牛血清、50μg/ml维生素C、10-8mmol/L地塞米松、10mM/L β-磷酸甘油。mAFDSCs经成脂或成骨诱导液诱导之后，每3d换一次诱导液。2周后吸去成脂或成骨诱导液，PBS洗2遍之后用4％多聚甲醛固定。用油红O对成脂诱导细胞染色，鉴定其成脂分化；用茜素红对成骨诱导细胞染色，鉴定其成骨分化。（3）重组杆状病毒构建，扩增及滴度测定。运用Bac-to-Bac操作系统（Life Technologies）成功构建Bv-GFP，经Sf9昆虫细胞扩增后，用极度稀释法进一步测其扩增后的病毒滴度。（4）当25cm2细胞培养瓶内sf9细胞长至80％时，加入1ml Bv-GFP病毒原液，并加入1ml PBS混匀后置于37℃冰箱孵育1h（摇晃1次/10min），之后倒掉病毒液，PBS洗2遍之后加入3.5ml Grace完全培养基，2d后用胰酶消化细胞并离心，倒掉培养基后PBS洗2遍，之后1.5ml PBS重悬sf9细胞并于液氮反复冻融3次后离心（2000r/min,10min），缓慢吸出病毒上清液并以1∶3的比例感染sf9细胞，最后扩增至20瓶75cm2培养瓶。反复冻融细胞收病毒，收集的病毒悬液于27000g离心3h，PBS重悬过夜，利用极度稀释法测定收集到的Bv-GFP的滴度。（5）P6代小鼠羊水干细胞种植于培养皿中，待其长至80％时，吸去培养基，用PBS洗2遍之后进行杆状病毒转导。依据培养皿中的细胞数，调整杆状病毒剂量，使感染指数（MOI）为500v.g/cell，并加入500μl PBS冲悬混匀病毒，将皿至于细胞培养箱孵育4h。4h之后吸去PBS，加2.5ml完全培养基于皿，并放置于37℃细胞培养箱继续培养。（6）杆状病毒转导后的小鼠羊水干细胞置于倒置荧光显微镜下,采用蓝光激发观察，发绿光的细胞定为阳性细胞。杆状病毒转导3d后的小鼠羊水干细胞用PBS洗2遍，0.25％胰酶消化，移至离心管于1500r/min离心5min,用500μl PBS重新悬浮，并吹散为单细胞悬液后使用流式细胞仪检测杆状病毒转导效率。每个细胞样品约（4～5）×105个细胞，以未经杆状病毒载体转导的细胞作为对照。（7）经Bv-GFP转导后的小鼠羊水干细胞进行成骨诱导分化，以未经病毒转导的羊水干细胞作为对照，方法同上。
2 实验结果
2.1 小鼠羊水干细胞形态及其生长方式 见图1。
2.2 羊水干细胞成脂成骨 羊水干细胞成脂见图2，羊水干细胞成骨见图3。
图1 P5代小鼠羊水干细胞（×100）图2 成脂诱导分化（×400）图3 成骨诱导分化（×400）
2.3 杆状病毒扩增、滴度测定 Bv-GFP经sf9细胞扩增后，极度稀释法测定其滴度为109v.g/ml。
2.4 杆状病毒转导倒置荧光显微镜摄像 见图4。
2.5 流式检测 见图5、6。
图4 （×200）
图5 阴性对照
图6 Bv-GFP转导效率52％
2.6 对照组细胞诱导成骨、病毒转导组细胞诱导成见 见图7、8。两组细胞成骨能力无明显差别，说明经杆状病毒基因载体转导后的小鼠羊水干细胞成骨分化潜能不变。
图7 对照组细胞诱导成骨（×200） 图8 病毒转导组细胞诱导成骨（×200）
3 讨论
羊水干细胞是从孕中期母体子宫羊水中提取出来的一类具有胚胎干细胞增殖分化特征的干细胞，有别于胚胎干细胞，又较成体干细胞有更大的分化潜能［3］，可分化成3个胚层的细胞且在体内不形成畸胎瘤［6，7］。2007年由美国家发现并将其命名为羊水干细胞(amniotic fluid stem cells, AFSCs)［6］。本实验成功从小鼠的羊水中培养出了干细胞，并在体外进行了的诱导分化成脂成骨，证实了羊水中存在有干细胞，且其有良好的增殖和分化潜能，是一种理想的组织工程种子细胞。
应用各种载体，如质粒、腺病毒、逆转录病毒，对干细胞进行体外基因修饰，增强其成骨分化潜能是骨组织重建工程研究的一个新方向，增强了干细胞应用于的骨组织修复临床的应用前景［14～18］。杆状病毒是一个新型的基因转导载体，以节肢动物为唯一宿主,可进入哺乳动物细胞但不被复制，也不和先前存在的病毒基因重组，在哺乳动物体内杆状病毒载体有极小的细胞毒性，它可容纳下30kb的DNA片段，单一的载体可转运大功能的基因或多基因，且具有高水平的转导率，载体相对容易构建和病毒生产有效滴度较高等优点［13］，可以被广泛应用于体内及体外［19，20］，是一种很有希望的基因载体。本实验成功地应用带绿色荧光蛋白的重组杆状病毒从体外转入小鼠的羊水干细胞，达到约52%的转导率，证实了重组杆状病毒能有效地转导羊水干细胞，且发现其转导后对小鼠羊水干细胞诱导分化成骨的潜能并无影响，为进一步应用带基因的重组杆状病毒体外转导羊水干细胞、促进其在体内的定向诱导分化成骨潜能奠定了基础。羊水干细胞及杆状病毒有着较前各类干细胞和病毒载体所不可比拟的优点，所以可以想象，重组杆状病毒基因修饰羊水干细胞诱导成骨这一新的病毒载体基因修饰的干细胞，对修复骨损伤模式将会有更好的临床应用前景。
【】
1 Cancedda R, Giannoni P, Mastrogiacomo M. A tissue engineering approach to bone repair in large animal models and in clinical practice. Biomaterials,2007 Oct,28(29):4240～4250. Epub 2007 Jul 20.
2 Waese EY, Kandel RR, Stanford WL Application of stem cells in bone repair. Skeletal Radiol,2008 Jan,12.
3 Kunisaki SM, Fuchs JR, Steigman SA, et al. A comparative analysis of cartilage engineered from different perinatal mesenchymal progenitor cells. Tissue Eng,2007 Nov,13(11):2633～2644.
4 Atala A. Engineering tissues, organs and cells. J Tissue Eng Regen Med,2007 Mar-Apr,2:83～96.
5 Siegel N, Rosner M, Hanneder M, ea al. Stem cells in amniotic fluid as new tools to study human genetic diseases stem. Cell Rev,2007Dec,3(4):256～264.
6 De-Coppi P, Bartsch GJR, Siddiqui MM, et al. Isolation of amniotic stem cell lines with potential for therapy. Nat Biotechnol,2007,25,100～106.
7 Tracy H, Ph D. Stem cells obtained from amniotic fluid. JAMA,2007,297:795.
8 Perin L, Sedrakyan S, Sacco S. Haracterization of human amniotic fluid stem cells and their pluripotential capability. Methods Cell Biol,2008,86:85～99.
9 Stefanidis K, Loutradis D, Koumbi L, et al. Deleted in Azoospermia-Like (DAZL) gene-expressing cells in human amniotic fluid: a new source for germ cells research? Fertil Steril, 2007 Nov,17.
10 Siegel N, Rosner M, Hanneder M, et al. Human amniotic fluid stem cells: a new perspective. Amino Acids,2007 Aug,21.
11 Gamradt SC, Lieberman JR. Genetic modification of stem cells to enhance bone repair. Ann Biomed Eng,2004 Jan,32(1):136～147.
12 Hannallah DB, Peterson JR, Lieberman FH, et al. Gene therapy in orthopaedic surgery. Instr Course Lect,2003,52:753～768.
13 Zeng J, Du J, Zhao Y, et al. Baculoviral vector-mediated transient and stable transgene expression in human embryonic stem cells. Stem Cells,2007 Apr,25(4):1055～1061.
14 Musgrave DSR, Pruchnic P, Bosch BH, et al. Human skeletal muscle cells in ex vivo gene therapyto deliver bone morphogenetic protein-2. J Bone Joint Surg,2002 Br,84:120～127.
15 Olmsted-Davis EA, Gugala Z, Gannon FH, et al. Use of a chimeric adenovirus vector enhances BMP2 production and bone formation. Hum Gene Ther,2002 Jul,13(11):1337～1347.
16 Cheng SL, Lou J, Wright NM, et al. In vitro and in vivo induction of bone formation using a recombinant adenoviral vector carrying the human BMP-2 gene. Calcif Tissue Int,2001 Feb,68(2):87～94.
17 Riew KD, Wright NM, Cheng S, et al. Induction of bone formation using a recombinant adenoviral vector carrying the human BMP-2 gene in a rabbit spinal fusion model. Calcif Tissue Int,1998 Oct,63(4):357～360.
18 Pola E, Gao W, Zhou Y, et al. Efficient bone formation by gene transfer of human LIM mineralization protein-3. Gene Ther,2004 Apr,11(8):683～693.
19 Chuang CK, Sung LY, Hwang SM, et al. Baculovirus as a new gene delivery vector for stem cell engineering and bone tissue engineering. Gene Ther,2007 Oct,14(19):1417～1424.
20 Kost TA, Condreay JP, Jarvis DL. Baculovirus as versatile vectors for protein expression in insect and mammalian cells. Nat Biotechnol,2005,23:567～575.
