甲氨蝶呤对大鼠输卵管雌孕激素受体的影响
作者：陈燕萍 郑飞云 杨孝军 王汉楚
【摘要】 目的 观察不同剂量甲氨蝶呤（MTX）对假孕SD大鼠输卵管雌孕激素受体的损伤，探讨MTX后对后续妊娠的潜在影响，为临床使用甲氨蝶呤保守治疗异位妊娠提供理性的合理选择。方法 40只SD雌性大鼠，致假孕状态后再MTX腹腔注射，随机分为1mg/kg组、2mg/kg组、5mg/kg组及对照组(腹腔注射生理盐水)，10d后处死各组大鼠，取双侧输卵管壶腹部组织，进行雌、孕激素受体的免疫组化染色。结果 ER阳性表达率在不同剂量组的差异具均有统计学意义(P<0.05)，表现为随着MTX剂量的增加，ER阳性表达下降。PR在MTX处理各组输卵管黏膜上皮中的表达与对照组差异无统计学意义（P>0.05）。结论 MTX可损伤输卵管雌激素受体，且损伤效应存在一定的量-效关系，提示临床中使用MTX保守治疗异位妊娠时，应减少剂量，否则可能会造成后续的再次异位妊娠或继发不孕。
【关键词】 甲氨蝶呤 输卵管 雌激素受体 孕激素受体
【Abstract】 Objective To investigate the adverse effect of increasing doses of methotrexate (MTX) on the fallopian tubes in rats and explore the dosage in which tubal pregnancy can be treated reasonably with methotrexate. Methods The study was carried out on 40 pseudocyesis SD rats. Increasing doses of MTX were administrated to the rats by intraperitoneal injection: 1 mg/kg in group 1, 2 mg/kg in group 2 and 5 mg/kg in group 3. Rats in group 4 only received injections of physiological saline and serve as control group. Ten days after the intraperitoneal injection, the fallopian tubes of the 40 rats were removed respectively and submitted to examination immunohistochemistry staining for the expressions of ER and PR. Results The immunohistochemical expression of estrogen receptor (ER) within endosalpinx significantly decreased in parallel with the increased doses of methotrexate (MTX)(among group 1,2,3:P<0.05); ER expression density in all treatment group were less than control group(P<0.05).However, the expression of PR within endosalpinx showed no significant difference among all treatment groups(P>0.05). Conclusions Decreased ER expression does occur within fallopian tubes resulting from administration of MTX at dose of greater than 1 mg/kg. Methotrexate should be used in a safe range of dosage in ectopic pregnancy in order to effectively avoided near or long-term impairment and complications which could contribute to certain degree in the causation of infertility and recurrent ectopic pregnancy.
【Key words】 Methotrexate Endosalpinx Estrogen receptor(ER) Pregesterone receptor(PR)
近年对输卵管妊娠的早期诊断率显著提高，使得药物保守治疗得以应用。目前，甲氨蝶呤（methotrexate, MTX）是输卵管妊娠的药物保守治疗中常用和首选的药物，该药可抑制滋养细胞增生，破坏绒毛，促使胚胎组织坏死、脱落，从而达到保守治疗输卵管妊娠的目的［1］。雌、孕激素受体广泛存在于女性生殖道组织中，两者的的协调表达状态与胚泡着床机制密切相关。本文首次系统研究不同剂量MTX对雌性假孕SD大鼠输卵管黏膜雌、孕激素受体的损伤效应及可能的量-效关系，探讨MTX治疗后输卵管损伤对后续妊娠的潜在影响，为临床使用MTX保守治疗异位妊娠提供理性的合理选择。
1 材料与方法
1.1 实验动物及试剂 雌性未孕SD(sprague dawley)大鼠40只，6～8周龄，体重180～200g，由温州医学院实验动物中心提供；甲氨蝶呤购自江苏恒瑞医药股份有限公司；妊马血清促性腺激素(Pregnant mare serum gonadotropin，PMSG)购自杭州动物药品厂；人绒毛膜促性腺激素(Human chorionic gonadotropin，HCG)购自丽珠集团制药厂；雌激素受体(estrogen receptors，ER)、孕激素受体(progesterone receptors，PR)单抗免疫组化试剂盒购自武汉博士德生物工程公司。
1.2 方法 （1）假孕大鼠模型的制备及MTX处理：40只雌性SD大鼠，清洁实验动物条件下饲养，置于室温25℃，正常的昼夜光照，实验前参照中使用的方法制作假孕模型［2］，所有大鼠皮下注射PMSG 50U，48h后再次皮下注射HCG 100U。致假孕状态后再行MTX腹腔注射，依剂量不同，假孕大鼠被随机分为1mg/kg（组Ⅰ，10只大鼠）、2mg/kg（组Ⅱ，10只大鼠）、5mg/kg（组Ⅲ，10只大鼠），另设置腹腔注射生理盐水0.5ml为对照组（组Ⅳ，10只大鼠）。MTX处理后10d，处死各组大鼠，因输卵管妊娠多发生在壶腹部，因此本研究取邻近卵巢部位的双侧输卵管壶腹部组织。所有标本用10%多聚甲醛固定，常规石蜡包埋，制成5μm厚的石蜡切片，进行雌、孕激素受体的免疫组化染色，观察不同组中MTX对输卵管雌孕激素受体的损伤效应与量-效关系。本研究中所有的动物实验均按照我国有关动物实验的立法进行。（2）免疫组织化学染色及判断标准：采用免疫组化SP二步法，参照文献中的方法判定染色结果［3］。每张免疫组化切片在200倍光镜下观察5个视野，阳性细胞表达占30%为(+)，占50%以上为(+++)，两者之间为(++)，未见阳性表达或只有极少数阳性细胞染色为阴性表达(-)。以PBS代替一抗作为阴性对照。
1.3 统计学处理 ER、PR的阳性表达率为计数资料，采用SPSS 10.0软件包建立数据库，进行统计分析；不同剂量MTX处理后的阳性表达率比较采用Kruskal-wallis检验。以P<0.05为差异有统计学意义。
2 结果
ER和PR阳性表达主要位于输卵管黏膜组织的上皮细胞核中，为棕黄色颗粒染色，空白对照中未见棕黄色染色，另外在输卵管壁肌纤维核中亦有少量ER和PR的阳性表达。结果显示，不同剂量MTX处理均下调了大鼠输卵管黏膜上皮组织中ER表达，经Kruskal-wallis检验，差异具有统计学意义(P<0.05)，详见表1和图1；不同剂量MTX处理对大鼠输卵管黏膜上皮组织中PR的表达不甚明显，经Kruskal-wallis检验，差异无统计学意义（P>0.05），详见表1和图2。表1 不同剂量MTX作用后假孕大鼠输卵管中ER、PR表达情况
3 讨论
3.1 MTX在输卵管妊娠保守治疗中的应用 近年来，随着盆腔炎症性疾病的增多，异位妊娠的发生率呈上升趋势。究其原因，主要的致病因素是各种原发、继发的输卵管器质性或功能性病变，如盆腔炎、盆腔手术、输卵管发育不良等机械性病变可损害输卵管结构及生理功能的完整性，影响输卵管内膜纤毛细胞的分泌和摆动，影响管壁平滑肌层的节律性收缩，干扰受精卵在输卵管中的输送，导致宫外孕或不孕症发生［4］。进一步的研究发现，输卵管壁的肌层收缩和纤毛细胞的摆动功能在一定程度上受输卵管局部组织中雌、孕激素的双重调节，局部平衡的激素环境对于协调受精卵的输送与完成正常的受孕过程至关重要，而雌、孕激素的协调作用紊乱，容易致输卵管妊娠［5］。甲氨蝶呤是输卵管妊娠的药物保守治疗中常用，并作首选的药物，该药可抑制滋养细胞增生，破坏绒毛，促使胚胎组织坏死脱落，从而达到保守治疗输卵管妊娠的目的［1］。有临床研究报道，MTX在保守治疗输卵管妊娠中获得了确切的疗效，可使输卵管内的异位妊娠组织完全溶解，无输卵管组织的损伤，特别适合年轻且希望保留生育功能的育龄妇女［6］。但亦有报道MTX治疗输卵管妊娠时有一定的远期并发症，如输卵管阻塞、复发性宫外孕等［7］。目前的研究较多集中在甲氨蝶呤对卵巢功能、月经恢复及生育功能的影响［4］，尚无甲氨蝶呤对输卵管结构与功能损伤的相关基础或临床研究报道。如今随着未生育输卵管妊娠患者的日渐增多，在使用MTX保守治疗异位妊娠的同时，保留和恢复输卵管正常结构与生理状态、维护患者的生育功能，逐渐成为临床治疗的需要。关于输卵管妊娠的动物模型，有报道人类与非灵长类动物在子宫与输卵管解剖、生理方面存在较大差异，目前无论在界或在实验室中，非灵长类动物的输卵管妊娠发生率很低［8］，Lee等［9］报道即使结扎大鼠输卵管后也很难制造出输卵管妊娠的动物模型。可见目前尚缺乏成功建立输卵管妊娠的确切动物模型［10，11］。故而本研究参照文献中采用的方法［2］，使用假孕SD大鼠，观察不同剂量MTX对在体输卵管雌、孕激素受体的损伤效应，首次系统研究甲氨蝶呤对假孕SD大鼠输卵管黏膜结构与功能的损伤效应，以及可能的量-效关系。
3.2 甲氨蝶呤对输卵管黏膜雌、孕激素受体的影响 雌、孕激素受体广泛存在于女性生殖道组织中，通常，ER、PR在子宫内膜腺上皮中的表达呈现周期性变化，增生期高表达、分泌期低表达，尤其PR在分泌期的子宫内膜腺上皮中表达迅速降低，甚至消失［12］；而分泌期是子宫着床窗开放时期，此时PR的低表达是子宫建立容受的前提之一［13］。可见，子宫内膜中的雌、孕激素受体的协调表达状态与胚泡着床机制较为明确。输卵管和子宫皆起源于苗勒氏管，故推测二者的受精着床机制相似。前述输卵管局部均衡的雌、孕激素环境对输卵管功能性运动和正常受孕的调节担任重要角色作用。生理状态下，输卵管黏膜及平滑肌的节律性收缩均随雌、孕激素水平呈周期性变化，雌激素可使输卵管肌层向伞端方向蠕动，并使输卵管峡部收缩，而孕激素可抑制雌激素的这种作用，雌、孕激素的协同作用，维持受精卵在输卵管内向宫腔方向正常运行，如某些因素使输卵管黏膜ER、PR表达下降或失调，输卵管局部低落的激素环境延缓受精卵在输卵管内的移行过程，可能发生与宫内妊娠相似的输卵管着床及妊娠［5］。还有研究认为分泌期ER、PR在输卵管上的表达与子宫内膜上相反，即分泌期输卵管上的高表达可避免受精卵在输卵管上着床，起到保护输卵管的屏障作用［14］。Jolande［15］和Sadan等［16］提出，输卵管妊娠的发生中，由于输卵管管壁存在某种缺陷，内膜的蜕膜反应差，输卵管璧中ER、PR的表达较弱，是导致输卵管妊娠的内在因素。郑萍等［17］的研究亦证实输卵管妊娠的管壁组织中孕激素含量显著降低，从而导致米非司酮的失败。还有研究表明促排卵药物克氯米芬因拮抗雌激素对输卵管运动的调节作用，从而成为其易致宫外孕的病理因素［18］。此外，辅助生育技术可能使患者处于高雌激素水平、低孕激素水平的状态，这种失调的激素状态亦会影响输卵管输送受精卵，从而易致输卵管妊娠或宫内、外同时妊娠［5］。本研究，在假孕SD大鼠输卵管中观察到不同剂量MTX在急性期、远期均显著下调输卵管黏膜上皮中ER的表达，均弱于对照组（P<0.05），并且随着MTX剂量的增大，ER的表达阳性率递减；而MTX处理各组输卵管黏膜上皮中的PR表达与对照组相比无明显改变（P>0.05），MTX对大鼠输卵管PR的损伤尚不能确定。可见，MTX处理后输卵管局部出现了不同程度的雌、孕激素受体表达下降或失调，且存在一定的量-效关系。如上所述，这些改变会潜在影响输卵管黏膜纤毛上皮和肌层的运动功能，失去了黏膜防护屏障的输卵管可能会在后续妊娠中发生再次输卵管妊娠或不孕。
总之，多年的临床实践证实，MTX在输卵管妊娠保守治疗中有确切疗效，但本研究首次揭示了MTX作用后的输卵管出现了结构及功能的损伤，且损伤效应存在一定的量-效关系，提示临床诊疗中使用MTX保守治疗异位妊娠时，应减少剂量，力求维持输卵管局部雌、孕激素受体的正常水平，否则可能会因输卵管的形态学改变或ER、PR表达下调，造成后续的再次异位妊娠或继发不孕。
【】
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