三氧化二砷对恶性B淋巴瘤细胞Raji的抑制作用
作者： 宋小珍 朱丽 单保恩 彭华
【摘要】 目的 研究三氧化二砷对B淋巴瘤细胞Raji的抑制作用和周期阻滞作用。方法 用MTT比色法检测不同浓度AS2O3对Raji细胞的体外增殖抑制率。用流式细胞仪检测AS2O3作用72小时后Raji细胞p21的表达变化和细胞周期的变化。结果 与对照组相比，各实验组细胞增殖明显下降。AS2O3可使Raji细胞周期阻滞于G0/G1期，并上调P21WAF1/CIP1的表达。结论 AS2O3可使Raji细胞阻滞于G0/G1期，其诱导周期阻滞的机制可能是通过上调P21WAF1/CIP1的表达。
【关键词】 P21WAF1/CIP1 三氧化二砷 细胞周期
【Abstract】 Objective To explore the inhibitory effect and cycle defect of arsenic trioxide on human B lymphoma cells. Method MTT method was used to observe the growth inhibitory rate of Raji cells treated with different dose of AS2O3 in vitro. The expression level of p21 and cell cycle was measured by flow cytometry in Raji cells treated with different dose of AS2O3 72h. Results All the treated cells showed significantly decreased proliferation compared with control cells in vitro as detected by MTT method. The cell cycle of Raji cells treated with AS2O3 was arrested in G0/G1 phase and AS2O3 can improve the expression of p21. Conclusion AS2O3 can arrest the cell cycle of Raji cells in G0/G1 phase. The possible mechanism may be through up-regulation of p21 expression.
【Key words】P21WAF1/CIP1 Arsenic trioxide Cell cycl
三氧化二砷是中药砒霜的主要成分，近年来因在急性早幼粒细胞性白血病方面取得了满意疗效而引起广泛的关注。研究表明，其作用机制可能是三氧化二砷影响了肿瘤细胞周期的，诱导细胞发生凋亡[1]。本实验以Raji细胞为研究对象，观察其是否能引起细胞周期阻滞及对周期相关基因表达的影响。
1 材料与方法
1.1材料 (1)细胞株:人B淋巴瘤细胞株Raji由河北医科大学第四科研中心保存。（2）药物：三氧化二砷为Sigma公司产品。（3）主要试剂：RPMI1640培养基购自美国GIBCO公司，胎牛血清购自杭州四季青公司，P21WAF1/CIP1鼠抗人单抗为北京中杉金桥生物公司产品。
1.2方法
1.2.1细胞培养 Raji细胞用含10%胎牛血清、100U/ml青霉素和100U/ml链霉素的RPMI1640完全培养基，置于37℃，5%CO2 饱和湿度条件下培养箱中培养，每2～3d换液一次，实验选用对数生长期细胞，设实验组与对照组，实验组分别用4、2、1μmol/l AS2O3处理细胞，未加药组为对照组。
1.2.2细胞生长抑制率的测定 采用MTT比色法进行检测。取对数生长期的细胞，调整细胞浓度为1.3×105 /ml。取96孔板数个，每孔加入上述细胞悬液100μl，再分别加入AS2O3的贮存液，使AS2O3的终浓度分别为0、1、2、4μmol/l。每种药物浓度为一组，每组设6个平行孔，根据实验设计继续培养24、48、72h后，每孔加入10μlMTT，在相同条件下再继续培养4h后取出，离心后吸去上清夜，每孔加入100μl二甲基亚砜，振荡10～15分钟，20分钟内在酶标仪上读取波长为570nm的吸光度A值，各浓度时间点取平均值，根据下列公式细胞生长抑制率：细胞生长抑制率（%）=（对照组A值－实验组A值）/对照组A值×100%。
1.2.3流式细胞仪检测细胞周期变化 收集不同浓度AS2O3处理的Raji细胞，用PBS清洗2次再将细胞沉淀充分混匀，用70%的冷乙醇4℃固定过夜，然后离心去除固定液，PBS清洗一次，RNA酶37℃处理1小时，与PI室温反应10min，用流式细胞仪测定，应用Single histogram statistic分析软件分析细胞周期变化。
1.2.4流式细胞仪检测P21WAF1/CIP1 蛋白的表达变化 收集不同浓度AS2O3处理的Raji细胞，用PBS清洗2次再将细胞沉淀充分混匀，用70%的冷乙醇4℃固定过夜，然后离心去除固定液，PBS清洗一次，加入 P21WAF1/CIP1单抗4℃孵育1h,再加入荧光标记的二抗孵育1h，用流式细胞仪检测并分析结果。
1.2.5统计学分析 数据分析用SPSS13.0软件处理。实验结果采用单因素方差分析和T检验，P ＜0.05为差异有显著性。
2 结果
2.1 AS2O3抑制Raji细胞的生长 见图1。AS2O3抑制Raji细胞生长具有时间、剂量依赖性。1、2、4μmol/l的AS2O3处理1～3天，对细胞的生长具有明显的抑制作用，差异有显著性意义（P ＜0.01）。
2.2 AS2O3诱导Raji细胞阻滞于G0/G1期 。1、2、4μmol/l的AS2O3处理72小时后，随着浓度的增加，G0/G1期细胞增加，G0/G1期细胞所占比例各实验组与对照组之间的差异有显著性意义（P ＜0.01），伴随着G0/G1期细胞数增加，S和G2/M期细胞数都减少。
2.3 AS2O3能上调Raji细胞P21WAF1/CIP1蛋白的表达 见图2。1、2、4μmol/l的AS2O3处理72小时后，随着浓度的增加，各实验组P21WAF1/CIP1蛋白的表达逐渐增强，各浓度组与对照组相比均有显著性差异（P ＜0.01）。1：4μmol/l AS2O3处理后 2：2μmol/l AS2O3处理后 3：1μmol/l AS2O3处理后 4：对照
异常增殖是恶性肿瘤的特征之一，抑制肿瘤细胞生长是肿瘤的途径之一。本研究结果显示，1、2、4μmol/l的AS2O3对Raji细胞的生长均有明显的抑制作用，随着药物浓度的增加和作用时间的延长，其抑制作用也逐渐增强，呈现浓度和时间依赖性。并且1、2、4μmol/l的AS2O3处理Raji细胞，G0/G1期细胞的比例明显增加，S和G2/M期细胞比例明显降低，提示AS2O3使Raji细胞阻滞于G0/G1期。
P21WAF1/CIP1基因定位于人染色体6p21.2,是P53的下游基因[2]，多项研究已证实P21WAF1/CIP1基因对肿瘤生长的抑制作用是确定的，是一种重要的抑癌基因，可通过其编码蛋白的表达来调节细胞周期，从而参与肿瘤的发生与[3]。P21WAF1/CIP1基因编码的蛋白是第一个被证实的细胞周期素依赖性激酶抑制因子 （CDK1），也是目前已知具有最广泛激酶抑制活性的细胞周期负性调节因子。通过依赖和非依赖P53途径，与包括CDK2、 CDK4在内的多种相应的Cyclins/CDK 复合物结合，使CDKs失活，减弱对Rb蛋白的磷酸化作用[4]，和（或）抑制细胞增殖核抗原（PCNA）活性，使细胞发生G1—S期阻滞，从而对细胞周期发挥负性调节作用，抑制细胞无限增殖[5]。
本研究结果显示，1、2、4μmol/l的AS2O3处理Raji细胞后，P21WAF1/CIP1基因的mRNA和蛋白表达水平均升高。提示P21WAF1/CIP1表达上调可能是AS2O3诱导肿瘤细胞发生细胞周期G0/G1期阻滞，从而发挥抗肿瘤作用的分子机制。
参 考 文 献
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