血清脂蛋白电泳法的操作与增速
来源：岁月联盟
时间：2010-07-12
血清脂蛋白电泳法是近些年临床上经常采用的一种检验方法，由于其分离和显色效果均不是很满意，目前不少实验室已废弃脂蛋白电泳法，改用脂蛋白胆固醇和载脂蛋白测定。
在国外，脂蛋白电泳方法已商品化，在分析速度精度等方面均可满足常规应用。参照有关方法和技术[1,5]，我们得到了一种适合于国内常规应用的脂蛋白电泳的快速分析法。
1 材料和方法
1.1 使用试剂
1.1.1 电极缓冲液 巴比妥钠25mmol/L，乙二胺四乙酸二钠0.94mmol/L,以1.0mmol/L HCI调Phg至8.6。
1.1.2 凝胶缓冲液：巴比妥钠30mmol/L，乙二胺四乙酸二钠0.94mmol/L，蔗糖146mmol/L，1.0mol/L HCL调pH至8.6（含聚乙烯吡咯烷酮K-60 5g/L）。
1.1.3 5g/L琼脂糖凝胶，以凝胶缓冲液制备并分装后，贮于4℃。
1.1.4 70g/L白蛋白溶液（北京化工厂）。
1.1.5 染色贮备液 脂肪红7B 0.6mmol/L，溶于无水甲醇中。
1.1.6 染色应用液 取贮液5ml，滴加0.1mol/L NaOH 1.0ml，用前制备。
1.1.7 漂染液 甲醇：水＝5:2（V/V）
1.2 操作方法
1.2.1 凝胶片制备 取无色透明的投影胶片（0.1mm），切成80×110mm，放于水平台面上用一内径为70×95mm的有机玻璃边框压在其上，将加热融化的琼脂糖冷至50～60℃，加白蛋白至终浓度约为2g/L，混合，轻轻铺于胶片上，使胶厚度为1mm左右，胶凝固后小心去除边框。
1.2.2 加样 用自制加样器制备样品槽[6]，加入血清样品3～5μl。
1.2.3 电泳 胶片放入预冷至4～8℃的电泳槽支架上，以四层滤纸与电极缓冲液连接，每个胶片恒流40Ma，电泳至区带展开约30mm（约需20分钟，加或不加指示染料）。
1.2.4 染色 胶片取出，于65℃左右烘干（约40分钟），放于水平盒中，加入新配的染色液覆盖整个胶片表面，放3～5分钟（可据室内温度而定）。
1.2.5 漂洗与干燥 除去胶片表面的染色液，浸入漂洗液中，轻轻摇动30秒，如所用漂洗液较少，可再换一次漂洗液洗30秒，转入65℃左右干燥（约10分钟）。
1.2.6 扫描测定 胶片点样面向下放入扫描载板上，用软纸蘸少量水轻轻擦去胶片背面的污迹，在520nm附近扫描测定。
2 结果和讨论
方法所得图谱清晰，区带平整，β-与前β-带分离较好，底色对测定基本无干扰，原点区无明显染料积存
用本法测定146例健康人，所得值范围（均值±SD）分别是： 52.2±5.4%、pre-β13.1±5.8%、α34.0±5.6%，与有关资料结果相近[2,4,5]。
脂蛋白带在电泳过程中易扩散和拖尾，本方法加入了一定浓度的蔗糖和白蛋白，保证了区带的平整，同时，在电泳时加大电场强度，使电泳在短时间内完成，区带可扩散的机会降低，所得区带较密集。应该指出，电场强度的加大，电泳过程中产热加快，因而在室温较高时，采用了将电泳槽预冷的方法，以减少过热造成脂蛋白带的分解。白蛋白浓度在2～5g/L间均可获良好结果。
β-与前β-带的分离好坏是脂蛋白电泳是否成功的关键技术问题，本方法用较低离子强度的缓冲液，降低胶浓度，并采用上述使区带密集的方法，较好地解决了这一问题。
染色中用新制备染料及用我们的方法制备加样槽可保证在原点区基本无干扰。由于染色液对脂蛋白较为敏感，对于高脂血样品在加样量要适当减少，否则区带的分辨率会下降，甚至导致错误的分型结果。
凝胶所用的支持体廉价易得，操作方便，有很好的本底重复性，并使结果灵活地长期保存成为可能。
经过实验认为，本方法快速、灵敏，适于大批量样品（至少每次20个）操作，适于在常规实验室应用，特别是对于脂蛋白测定的商品化将有所帮助。
参 考 文 献
[1] 秦文斌，等.中华医学杂志，1998，56（8）：506.
[2] 禇量子，等.临床检验杂志，1995，3（2）：25.
[3] 上海第一医学院中山中心实验室，等.中华医学杂志，2001，55（1）：49.
[4] Beckman Instruents Inc. Pragaon elec-trophoresis system Reference Manual. Brea,California,2003
[5] Ciba-Cornig Diagnostics Corp. Clinical Electrophoresis Reference Manual. Medi-field,MA,1998
[6] 闪全忠.临床检验杂志，1991，9（1）：20.
