HCV感染者外周血T细胞PD-1的表达水平研究
【摘要】 目的 探讨HCV感染者外周血T细胞程序性死亡受体1 (programmed cell death1, PD-1)表达情况及与血清学指标的相关性。方法 应用流式细胞术检测43例HCV感染者外周血T淋巴细胞PD-1及其配体B7-H1水平，与29例正常健康人作比较；COBAS AMPLICOR自动载量仪检测HCV感染者血清病毒载量，同时进行肝功能检测。结果 HCV感染组T细胞PD-1/ B7-H1表达水平明显高于对照组（P<0.01）；HCV RNA阳性组外周血T细胞PD-1表达水平与病毒载量存在统计学正相关关系(r=0.442，P<0.01)；HCV感染组PD-1分子的表达水平与血清转氨酶成正相关(r=0.626，P<0.01)。结论 HCV感染后外周血T细胞PD-1表达水平明显升高，从而抑制T细胞的免疫功能，导致病毒持续感染并造成肝细胞进一步损伤。
【关键词】 丙型肝炎病毒 细胞程序性死亡受体1 病毒载量
【Abstract】 0bjective: To investigate the expression of programmed cell death 1 in peripheral T lymphocytes in patients with hepatitis C and its relationship with serological markers. Methods: Techniques of flow cytometry and COBAS AMPLICOR were used to detect PD1and B7-H1 in peripheral T lymphocytes and viral load of 43 patients with Hepatitis C and 29 controls respectively. liver function was also measured. Results: 1evels of PD-1 and B7-H1 were significantly higher in patients with hepatitis C than those in healthy controls (P<0.01) and there was statistical positive correlation between 1evel of PD-1 in peripheral T lymphocytes and viral load in positive HCV-RNA patients(r=0.442，P<0.01).moreover, the 1evel of PD-1 in patients with hepatitis C was positively correlated with the 1evel of ALT(r=0.626,P<0.01). Conclusion: the high-level expression of PD-1 after HCV infection inhibits the immune function of T lymphocytes and thus leads to the virus persistent infection and further damage of hepatic cells.
【Key words】HCV PD-1 Viral load
丙型肝炎病毒( Hepatitis C virus，HCV)是导致肝硬化和肝细胞癌的主要病原体之一[1]。全球约1.7亿人感染HCV，我国HCV的感染率约为3.2%，HCV抗体携带者达4 000万[2]。丙型肝炎慢性化率达到50%～85%，危害十分严重[3]。丙肝感染慢性化是由于在感染初期，机体缺乏强有力的、HCV特异的CD8+ T细胞和CD4+ T细胞应答。PD-1是表达于T细胞与B细胞表面的共刺激分子，在T、B细胞的免疫应答中起负向调控作用[4]，与其配体PD-L1和PD-L2作用，可削弱、限制或终止T细胞发挥功能[5]。近来有研究表明, HCV持续感染中表位特异性T淋巴细胞处于功能耗竭状态，这种功能低下与其表面PD-1分子的高表达密切相关，阻断PD-1与其配体PD-L1的相互作用可使病毒特异性CTL的功能部分恢复，促进病毒清除[6]。但目前国内有关HCV感染者外周血T细胞内PD-1表达水平和病毒载量的关系以及与其他血清学指标间到底有怎样的联系还少有报道。为此，我们采用流式细胞技术对HCV感染者外周血T细胞中PD-1及其配体B7-H1表达水平与血清病毒载量、转氨酶含量之间进行相关性分析，以明确HCV感染后患者外周血T细胞内PD-1的表达变化情况及其对机体免疫状态的影响。
1 材料与方法
1.1 研究对象 43例HCV感染者均来自本院门诊和住院患者，其中男性28例,女性15例；年龄23～66岁(平均34.6±10.3岁)。病例诊断均符合2004年中华医学会传染病和寄生虫病学分会、肝病学分会联合制订的丙型肝炎防治指南[7]。同时排除合并其他类型肝炎病毒、人类免疫缺陷病毒(HIV)感染以及酒精性肝病等。另选年龄和性别与病人相匹配的健康志愿者29例作为正常对照(health control，HC)。
1.2 主要试剂和仪器 美国BD FACS Calibur型流式细胞仪购于Becton Dickinson公司，全自动病毒载量测定仪COBAS AMPLICOR购于Roche公司。免洗溶血素以及TriTESTCD3PerCP购于Becton Dickinson公司；单克隆抗体CD3-PreCP购于Becton Dickinson公司；PD-1-PE、B7-H1-PE购于Bioscience公司。HCV DNA检测用试剂盒购自Roche公司。肝功能由日本Olympus生化分析仪检测。
1.3 实验方法
1.3.1密度梯度离心法分离外周血单个核细胞 离心管中加入Ficoll-Hypaque淋巴细胞分离液15ml，沿管壁缓慢加入用PBS稀释后的抗凝全血30ml，离心400g，30min。用毛细管吸取界面层的PBMC并加入5倍体积的PBS缓冲液，洗涤细胞2次。
1.3.2 外周血B7-H1/PD-1表达检测 向3支流式管中各加入1x106密度梯度离心法分离的HCV感染者及健康人PBMC，每管加入荧光标记的单抗CD3-PerCP、10ul， CD3-PerCP、B7-H1-PE各10ul ,CD3-PerCP、PD-1-PE各10ul，混匀后4℃避光染色30分钟，用PBS洗涤后加入含1%多聚甲醛的PBS重悬，FACS Aria流式细胞仪Diva软件进行分析。
1.3.3 病毒载量检测 以200μl血浆采用标准版模板制备法提取RNA，采用Roche公司HIV-1 Monitor 1.5 commercial kit 在COBAS AMPLICOR自动载量仪上以RT-PCR方法测定病毒载量。
HIV-1感染者的病毒载量转化为以10为底的对数进行统计分析。
1.3.4 统计学方法 统计学处理采用SPSS16.0统计软件，数据采用 ±s表示，健康人与患者B7-Hl和PD-1表达水平的比较经方差齐性检验，两组间比较采用配对t检验，Spearman法进行组间相关性分析。
2 结 果
2.1 HCV感染者外周血T细胞PD-1及B7-H1的表达水平和健康对照相比，HCV感染者外周血T细胞PD-1及B7-H1的表达水平显著增高（P值<0.01）
2.2 PD-1表达水平与病毒载量的相关性
32例RNA阳性的HCV感染者病毒载量与外周血T细胞PD-1表达水平呈明显正相关（r=0.442，P P<0.01）
2.3 HCV感染组PD-1分子的表达与血清转氨酶水平的相关性
进一步分析显示，HCV感染者外周血T细胞PD-1表达水平与血浆ALT水平呈明显正相关（r=0.626，P<0.01）。
3 讨论
HCV感染的特点是外周血和肝脏中存在病毒特异性T细胞，但却缺乏功能强大、表型成熟的HCV特异性CD4+T细胞和CD8+T细胞[7]。HCV感染后导致特异性免疫应答水平快速下降，这可能是病毒本身造成的特异性免疫应答削弱的结果。事实上，人类由于HCV造成的适应性免疫应答削弱方面已有关于树突状细胞和辅助性T细胞的报道。最近，一些研究表明，HCV感染后依赖CD4+T细胞的效应性CD8+T细胞功能减弱，这和在HIV感染者身上的发现类似。而要维持一个强有力的、持续的T细胞应答就必须传递给T细胞三个信号[8]:一是通过T细胞受体传递；二是通过表达在T细胞和抗原提呈细胞上的共刺激分子传递；三是通过应答T细胞释放的细胞因子传递。其中一个或多个缺陷都会造成T细胞功能障碍。在多条共刺激信号途径中，负向的协同共刺激分子PD-1及其配体B7- H1的信号途径被认为与病毒感染关系最为密切。PD-1通过与B7-H1结合后抑制T淋巴细胞反应,包括T淋巴细胞删除和凋亡、抗毒性杀伤、抑制增殖和诱导并维持T淋巴细胞功能衰竭[9,10]。近来的研究发现，在小鼠LCMV和人HIV，HBV等病毒持续感染中，病毒特异性T细胞处于功能障碍状态，其表面PD-1高表达。利用B7- H1阻断性抗体阻断PD-1与其配体B7-H1的相互作用后发现病毒特异性T细胞增殖增加，这提示PD-1在病毒感染慢性持续状态下对效应性T细胞起重要调节作用。
综上所述，HCV感染者PD-1及其配体B7-H1的表达与疾病转归密切相关，在人体免疫系统及其抗HCV免疫应答中可能发挥了重要作用，深入研究PD-1/B7-Hl信号途径对HCV感染免疫功能的影响及调节免疫功能的机制，将对理解共刺激分子家族的相互关系及其复杂性具有重要意义，同时也为阐明HCV感染T细胞免疫耐受的可能机制及临床免疫提供新的思路。
参 考 文 献
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