不同浓度的软脂酸对INS-1细胞功能及凋亡的影响

                   作者：郭亚菊，莫朝晖，陈科，谢晓云

【摘要】  目的 观察不同浓度软脂酸在不同时间内对INS-1细胞功能及凋亡的影响。方法 分别将0、0.1、0.2、0.3、0.4mmol/L软脂酸与胰岛INS-1细胞6h，24h，使用MTT、流式细胞技术及RT-PCR检测INS-1细胞胰岛细胞活力、凋亡率以及胰岛素基因表达，并检测细胞胰岛素分泌量。结果 胰岛INS-1细胞在软脂酸中培养6h时，随着软脂酸浓度的增加，基础胰岛素分泌量增加(P<0.05)，凋亡率无明显变化，而经软脂酸干预24h时，随着软脂酸浓度的增加，胰岛INS-1细胞基础胰岛素分泌量减少，凋亡率明显增加，胰岛素基因表达减弱。结论 长期高脂损害INS-1细胞功能活性、促进β细胞凋亡。

【关键词】  软脂酸;胰岛INS-1细胞凋亡;脂毒性

肥胖是2型糖尿病重要的危险因素，两者均伴有明显的高胰岛素血症、胰岛素抵抗和脂代谢异常。2型糖尿病中糖代谢紊乱的原因之一则为脂代谢异常，因此脂毒性越来越受到重视。目前有人提出脂代谢异常开始早于血糖的升高,可能为糖尿病的始动因素,故提议将糖尿病改为“糖脂病”，但也有人认为高血糖是发生脂毒性的先决条件,若无高血糖,脂毒性也难以发生。为此，本研究观察软脂酸在不同浓度及在不同时间内对胰岛INS-1细胞功能及凋亡的影响。

　　1 材料与方法

　　1.1 材料与试剂 胰岛INS-1细胞株(武汉细胞典藏中心);软脂酸(sigma公司)，胰岛素放免试剂盒(北京科美东雅生物技术公司)，RT-PCR所需试剂(华美公司)，细胞培养基(Bibico 含糖)，胎牛血清(四季青公司)。

　　1.2 实验方法

　　1.2.1 细胞培养与实验分组 将大鼠胰岛素瘤INS-1细胞于含10%FBS的RPMI1640完全培养基(10%胎牛血清，11.2mmol/L葡萄糖，10mmol/L Hepes，1mmol/L丙酮酸钠，50μmoL/L β巯基乙醇，100μ/ml青霉素和100ug/ml链霉素)中培养，隔天换液1次，7天传代1次，取对数生长期细胞用于实验。

　　取生长良好的INS-1细胞，接种于6孔板，培养至细胞融合60%～70%后，对照组(control)加不含软脂酸的完全培养基2ml，实验组分别加入含0.1mmol/L、0.2mmol/L、0.3mmol/L、0.4mmol/L软脂酸的完全培养基2ml，每组设4个重复孔，37°C，5%CO2条件下孵育。

　　1.2.2 胰岛素测定 各组分别于孵育6h 、24h收集上清液，-20°C保存，用放免法测定胰岛素含量。

　　1.2.3 MTT细胞活力测定 以每孔5000个细胞接种到96孔板，待细胞贴壁2天后加入PBS配置的5mg/ml的MTT 20μl，孵育4h，终止培养，吸弃上清液，加入150μl DMSO，摇床震荡10min，酶联免疫检测仪上570nm波长测定吸光值。

　　1.2.4 细胞凋亡检测 将干预完成的细胞制成单细胞悬液，1000r/min离心5min，弃上清;用4℃预冷的70%冷乙醇固定，悬起细胞，用封口膜封紧，4℃保存;调整细胞浓度为106细胞/ml，取1ml细胞悬液，用PBS洗3次，细胞重悬于1ml PI染液中，37℃孵育30min即可进行流式分析;PI染液终浓度为50μg/ml，RNase A终浓度为20μg/ml;流式细胞分析仪 MCYCLE 软件分析系统可正常、凋亡和死亡细胞群的百分数。

　　1.2.5 RT-PCR检测胰岛素mRNA的表达 INS-1细胞在分别经过含0mmol/L、0.1mmol/L、0.2mmol/L、0.3mmol/L、0.4mmol/L软脂酸的完全培养基中培养24h，用PBS洗涤2遍后，用Trizol等试剂提取总RNA，取2μl总RNA，以Oligo(dT)18primer为引物，在25μl反应体系中用AMW反转录进行反转录合成cDNA第一条链，根据INS-1细胞胰岛素cDNA序列结合，以GADPH为内参;胰岛素引物序列为：上游5'-CCAGGCTTTTGTCAAACAGCA-3'，下游5'-ACGGGACTTGGGTGTGTATAGAA-3';GADPH引物序列为5'-TGGGTGTGAACCACGAGAA-3'，下游引物为5'-GGCATGGACTGTGGTCATGA-3';反应条件：94℃ 预变性3min; 94℃ 3 s, 54℃ 40s, 72℃ 40s,共30个循环; 72℃再延伸5min。

　　1.3 统计学处理 所有数据均重复3次以上，以x±s表示,结果应用SPSS 10.0软件处理,各组均数经方差齐性检验后,组间比较用单因素方差分析。

　　2 结果

　　2.1 不同浓度软脂酸对INS-1细胞基础胰岛素分泌影响的动态变化 INS-1细胞分别在0.1mmol/L，0.2mmol/L，0.3mmol/L，0.4mmol/L的软脂酸中完全培养基培养INS-1细胞6h后，基础胰岛素分泌均较对照组增加(P<0.05)，各组之间无差异;培养24h后0.1mmol/L 、0.2mmol/L 、0.3mmol/L基础胰岛素分泌量逐渐减少，0.4mmol/L PA时较0.2、0.3mmol/L PA时增加(见表1)，且具有统计学意义(P<0.01)。表1 不同浓度软脂酸在不同时间对INS-1细胞基础胰岛素分泌的影响注：与对照组相比*P<0.05，与0.1PA组相比较△P<0.01，0.4PA组与0.2、0.3PA组比#P<0.01

　　2.2 不同浓度PA干预后MTT检测 软脂酸干预6h时，0.1mmol/l低浓度实验组MTT值与对照组无差异P>0.05，而较高浓度(0.2mmol/LPA，0.3mmol/LPA、0.4mmol/LPA)组MTT值较对照组明显降低(P<0.05)，而较高浓度各组见无明显差异，而经干预24h，不同浓度软脂酸组均较对照组OD值明显降低(P<0.05)，且随软脂酸浓度增加呈递减性。表2 不同浓度PA干预后OD值 注：与对照组相比*P值<0.05，组间两两相比△P<0.05，有统计学意义

　　2.3 流式细胞检测软脂酸对INS-1细胞凋亡的影响 与对照组相比，INS-1细胞在不同浓度的软脂酸中培养6h，细胞凋亡无明显变化，而培养24h时 随着软脂酸浓度的增加，细胞凋亡率逐渐增加。表3 不同浓度PA在不同时间时INS-1细胞凋亡率(%) (x±s)注：与对照组相比*P值<0.05，各组间相比△P<0.01，有统计学意义

　　2.4 软脂酸对INS-1细胞胰岛素基因表达的影响 软脂酸干预胰岛INS-1细胞6h后，与对照组比较，各浓度组胰岛素基因mRNA表达无明显变化，而软脂酸干预24h后胰岛素基因mRNA表达明显减弱。 注：图中1、2、3、4、5分别代表软脂酸的浓度为0mmol/L、0.1mmol/L、0.2mmol/L、0.3mmol/L、0.4mmol/L，A代表PA干预6h组，B代表PA干预24h组

　　图1 软脂酸对INS-1细胞胰岛素 mRNA的影响

　　3 讨论

　　本研究所用INS-1细胞来自于大鼠胰岛素瘤细胞株，能稳定的分泌胰岛素，可以用于研究胰岛素β细胞的理想细胞，为了进一步明确游离脂肪酸对INS-1细胞脂毒性的作用，本实验观察了不同浓度软脂酸在不同时间对胰岛INS-1细胞功能及凋亡的影响。结果显示在短时间(6h)内，游离脂肪酸能刺激胰岛INS-1细胞分泌胰岛素，且呈浓度依赖性，这可能与短时间内游离脂肪酸可刺激胰岛细胞发生胞吐作用有关;软脂酸干预6h时胰岛素基因表达无明显变化，进一步证明短期内游离脂肪酸刺激胰岛素分泌是通过细胞的胞吐作用实现的。同时流式细胞仪观察细胞凋亡率无明显变化，但MTT显示细胞活力减弱，而游离脂肪酸作用24h时，INS-1细胞凋亡率明显增加，随着软脂酸浓度的增加，细胞凋亡率逐渐增加。同时胰岛素分泌量减少，但在本实验中观察到0.4mmol/L PA时基础胰岛素分泌量增加，可能与软脂酸浓度增加，INS-1细胞凋亡较多，发生自溶，胰岛素释放入培养液中有关。且有研究表明[1]，暴露于0.4μmol/L软脂酸12h时观察到了细胞的自溶现象，这一研究支持本实验的结论，磷酸-mTOR是抑制自溶活化的一个经典信号通路，在INS-1细胞经过PA处理后，观察到P-mTOR逐渐减少;游离脂肪酸在细胞内被氧化后通常是无毒的[9]，然而长链的辅酶或者是酯类的衍生物如甘油三酯、溶血卵磷脂、神经鞘脂他们可以促进β细胞的凋亡[2];神经酰胺已经被提出可能是游离脂肪酸介导β细胞凋亡的介质[3～6];内质网应激和氧化应激是游离脂肪酸介导β细胞凋亡的关键因素，已经提示与细胞的自溶有关[7,9]。

　　对于PA作用于胰岛细胞24h时，INS-1细胞基础胰岛素分泌量减少，且从胰岛素基因RT-PCR结果分析，是由于软脂酸长时间作用于INS-1细胞，使胰岛素基因的转录和翻译减少所致，有研究报道游离脂肪酸短时间及长时间作用于INS-1细胞引起细胞功能改变完全是通过不同的机制及信号通路所致。

　　对于PA作用于胰岛细胞24h时，INS-1细胞基础胰岛素分泌量减少，且从胰岛素基因RT-PCR结果分析，是由于软脂酸长时间作用于INS-1细胞，使胰岛素基因的转录和翻译减少所致，有研究报道游离脂肪酸短时间及长时间作用于INS-1细胞引起细胞功能改变完全是通过不同的机制及信号通路所致。本研究结果观察游离脂肪酸短时间和长时间对INS-1细胞功能不同影响机制也需进一步研究，但长时间高游离脂肪酸可促进胰岛细胞凋亡，甚至可能发生胰岛细胞的自溶。

【】
  　1 Sung-E Choi, Sung-Mi Lee, Youn-Jung Lee,et al.Protective role of autophagy in palmitate-induced INS-1 beta cell death. Endocrinology,2008,150(1):126-134.

　　2 Assimacopoulos-Jeannet F.Fat storage in pancreas and in insulin-sensitive tissues in pathogenesis of type 2 diabetes. International Joural of Obesity ,2004,25:53-57.

　　3 Lupi R, Dotta F, Marselli L, et al. Prolonged exposure to free fatty acids has cytostatic and pro-apoptotic effects on human pancreatic islets: evidence that beta-cell death is caspase mediated, partially dependent on ceramide pathway, and Bcl-2 regulated. Diabetes, 2002,51:1437-1442.

　　4 Maedler K, Spinas GA, Dyntar D,et al.Distinct effects of saturated and monounsaturated fatty acids on beta-cell turnover and function. Diabetes,2001,50:69-76.

　　5 Shimabukuro M, Zhou YT, Levi M, et al.Fatty acid-induced beta cell apoptosis: a link between obesity and diabetes. Proc Natl Acad Sci USA,1998, 95:2498-2502.

　　6 Okuyama R, Fujiwara T, Ohsumi J.High glucose potentiates palmitate-induced NO-Mediated cytotoxicity through generation of superoxide in clonal beta-cell HIT-T15. FEBS Lett ,2003,545:219-223.

　　7 Hansen M. Connecting endoplasmic reticulum stress to autophagy by unfolded protein response and Ca2+. Cell death and differentiation,2007,14:1576-1582.

　　8 Scherz-Shouval R, Elazar Z.ROS, mitochondria and the regulation of autophagy. Trends Cell Biol ,2007,17:422-427.

　　9 Vincent Poitout, Derek Hagman. Regulation of the Insulin Gene by Glucose and Fatty Acids .J Nutr,2006,36(4): 873-876.