温州地区180名10周岁儿童CYP3A酶活性分布
作者：林光勇，周严灿，王增寿，路黎
【摘要】 目的：调查温州地区180名10周岁儿童细胞色素P450 3A酶活性（cytochrome P450 3A activity，CA）的分布情况及正常值范围。方法：采用HPLC梯度洗脱法测定尿液中氢化可的松和6β?羟基氢化可的松浓度，以6β?羟基氢化可的松与氢化可的松的浓度之比来表示CYP3A酶的活性。结果：180名10周岁儿童CA分布不呈正态分布，变异系数为2.96，变异系数的标准误为0.13，偏度系数>1。受检者CYP3A酶的平均活性为（4.8±1.9），其中男孩为（4.4±1.6），女孩为（5.1±1.9）。温州地区10周岁儿童CYP3A酶的活性无性别差别，正常范围值是0.85～21.52。结论：通过对180名10周岁儿童CYP3A酶活性的测定，推断出该年龄正常值范围，可为制定儿童个体化给药方案提供依据。
【关键词】 细胞色素P450 3A酶；6β?羟基氢化可的松；氢化可的松；儿童；分布；尿液
细胞色素P450（cytochrome P450，CYP）是人体内代谢药物的主要酶系，其中CYP3A参与人体大约50%以上的药物代谢，其活性改变可使药物的动力学产生个体化差异［1］。CYP3A有4种亚型：CYP3A4、CYP3A5、CYP3A7和CYP3A43。CYP3A4和CYP3A5是CYP在人体内的主要亚型，CYP3A4主要存在于肝脏和肠道，占CYP总量的30%～40%，CYP3A5主要存在于肾脏，对药物代谢的影响能力较CYP3A4小得多［2］。CYP3A7主要在于婴儿期，而CYP3A43对药物的代谢的影响最小［3］。CYP3A活性（CYP3A aetivity，CA），通常是指CYP3A4、CYP3A5和CYP3A43的活性总和。在测定CA方面，氢化可的松法［4］是近年来应用较多、也较为安全的一种方法。氢化可的松法将人尿中6β?羟基氢化可的松和氢化可的松的含量比值作为衡量CYP3A活性的生物探针已得到许多学者的认可［3?5］。本实验采用HPLC梯度洗脱法测定180名10周岁健康儿童24 h尿液中氢化可的松（hydrocortisone，HC）及其代谢产物6β?羟基氢化可的松（6β?hydroxycortisol，6β?OHC）的含量，其比值来衡量CYP3A的表型活性，旨在了解该年龄段儿童中CA的分布情况。
1 仪器及试药
HP1100 HPLC（美国Hewleft?Packand公司），包括：G1311A四元梯度泵，G1322A真空脱气机，G1313A自动进样器，G1317A二维液相工作站。氢化可的松对照品（美国sigma?aldrich公司，批号39L1091），6β?羟基氢化可的松对照品（美国sigma?aldrich公司，批号28L1144）；内标为地塞米松（美国sigma?aldrich公司，批号81K1110）；甲醇、乙腈均为色谱纯；硫酸铵为分析纯（上海金山化工厂，批号20060102），其它试剂为分析纯，水为多重纯化水。
2 对象与方法
2.1 研究对象
按学号在温州市鹿城区、平阳县、文成县小学五年级学生中随机选取10周岁健康儿童180名，其中男生88名，女生92名，汉族，无肝肾疾病。在样品收集前2周，所有儿童未服用任何药品及釉子、咖啡因等影响酶活性的药物和食物，尿常规检验指标均正常。
2.2 样品的采集与处理
每位入选儿童留取晨尿10 mL，置于具塞试管内，放入-20 ℃冰箱中待测。取8 mL尿液加入试管中，随后加入0.1 g/L内标液20 μL和1 mol/L的氢氧化钠溶液0.1 mL，振荡30 s后加入3 mL醋酸乙酯?乙醚（4∶1，V/V）混合液，室温下振荡10 min，10 000 r/min离心10 min，去水相，提取有机相，加入2 mL含有饱和硫酸钠的1 mol/L氢氧化钠溶液进行定量洗脱，振荡后10 000 r/min离心10 min，有机相同前再用含有饱和硫酸钠的1%醋酸溶液洗脱后，取有机相4 mL在45 ℃～50 ℃水浴中以氮气流浓缩蒸干，残渣用100 μL甲醇溶解，振荡混合，备用。
2.3 测定尿液中氢化可的松和6β?羟基氢化可的松的含量
采用HPLC内标法测定尿液中氢化可的松和6β-羟基氢化可的松的含量，内标为地塞米松，色谱柱为HP HyrPersil ODS柱（250 mm×4 mm，5 μm），流动相为乙腈（A相）和1%硫酸铵（B相）；柱温30 ℃；流速1.0 mL/min；检测波长UV 240 nm。流动相梯度洗脱详见表1，取处理完毕的样品20 μL进样，进行色谱分析。表1 梯度洗脱的程序表（略）
2.4 标准曲线的绘制
分别精密标取HC、6β?OHC适量，用甲醇稀释成1 mg/mL作为储备液，临用前分别配制HC、6β?OHC 50、100、200、500、1 000、2 500 ng/mL，按“2.2”项下方法处理并进行测定。采用内标法，以色谱峰面积（X）为纵坐标，药物浓度（Y）为横坐标，进行回归，得到标准曲线方程分为HC：Y=4.5641X-0.8672（r=0.9995）；6β?OHC：Y=4.1256X-0.7763（r=0.9996）；按信噪比>3，测定HC、6β?OHC的最低检测限为0.5 μg/L。
2.5 回收率试验
将尿液与氢化可的松和6β?羟基氢化可的松配制成10、200、1 200 μg/L的溶液各5份，按“2.2”项的方法处理并测定，将样品与标准尿液峰面积比分别代入标准曲线，所得浓度差值和投入量的比值即为相对回收率，结果见表2。表2 加样回收率试验结果（略）
2.6 酶活性计算
分别以HC、6β?OHC的色谱峰面积代入各自标准曲线，得到其浓度。CYP3A酶活性=6β?OHC/HC，由于酶活性是两个浓度的比值，所以无单位。
2.7 统计学分析
所有数据的统计分析均等用 SPSS统计软件（版本11.5），正态分布测试用Kolmogorow?smimor检验，CYP3A酶活性采用单变量频数分布分析方法进行统计，男女间酶活性之间的比较采用两个独立样本的t检验。
3 结果
3.1 儿童CA的分布特征
180例10周岁儿童的CA数据经Kolmogorowv?smimor检验，Z值为3.9656，P<0.01，为非正态分布。采用单变量频数分布分析方法进行统计，得到其变异系数为2.96，变异系数的标准误为0.13，偏度系数>1，表明数据的分布呈左偏态分布，由于非正态分布的数据不能进行常规统计参数分析和直接平均值和标准差，必须将数据作数学处理转换为符合正态分布的统计资料。将CA数据取常用对数后，其变异系数为0.3865，变异系数<1，数据呈正态分布，结果见图1。
3.2 温州地区10周岁儿童CA正常值估计
正常值范围通常指95%的人群分布区间（即a=0.05）。lgCA的分布符合正态分布，先求出lgCA的统计参数，然后再转换为CA的数值。取a=0.05，正常值范围=均值±1.96×标准差。分析结果见表3，以性别为参数，经t检验，男、女生之间酶活性差异无统计学意义（P＞0.05）。
表3 温州地区10岁儿童CA及其正常值范围估计（略）
4 讨论
由CYP3A酶所催化的Ⅰ相反应是药物在体内代谢的关键一步，药物在体内的药动学差异往往是由于参与代谢的CYP3A酶活性存在较大个体差异所致。深入研究了解CYP3A酶活性，可为指导临床个体化用药提供依据。
目前，测定CYP3A酶活性的探针种类较多，有红霉素呼吸试验、咪唑安定、氢化可的松［6］等，各个方法都有其优缺点。由于氢化可的松是内源性化合物，在人体内CYP3A酶的介导下生成6β?羟基氢化可的松，而人尿中6β?羟基氢化可的松与氢化可的松比值与人体CYP3A诱导能力相关。此法仅采用志愿者的尿液做样本，是目前最安全、损伤性最小的酶活性测定方法。较适合于儿童CA的测定，并有利于推广应用。
由于本实验结果可知，CA分布范围较广，正常值从0.85～21.52相差约25倍，CA平均值为（4.8±1.9）。此范围内儿童对相关药物的代谢能力，可以认为是该年龄儿童的平均水平。在此范围儿童用药时，可参考正常用药剂量，不必进行剂量调整，而酶活性<2.9的儿童可考虑适当减少剂量，防止药物积蓄。相反，酶活性高于6.7的儿童用药时可相应提高剂量，避免达不到有效血药浓度。
从表3还可以发现，女生均数较男生高出17.12%，虽经检验差异无统计学意义，但这种差别应引起足够的重视。临床上要切实观察男女生在药物处置方面的实际差异，有必要的话，男女生用药剂量可区别对待。这与一些研究发现［3］氢化可的松探针有一定的性别差异结论相符，与张顺国［7］等对上海地区210名12周岁儿童CYP3A活性分布的研究结果相似。有报道［5］19～27岁健康人CA为（5.30±4.60）（n=82），与本实验中10岁儿童测定结果（4.8±1.9）相近，可初步推断6β?羟基氢化可的松的浓度与氢化可的松的浓度之比代表CA是稳定的。
通过对180例10周岁在校学生CYP3A酶活性的测定，推断出温州地区该年龄正常值范围，为进一步研究药物代谢与CA的相关性，为确立儿童个体化给药方案提供科学依据。
【参考文献】
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