Survivin反义核酸影响A549肺癌细胞增殖和凋亡的研究

                  作者：郑人源　蒲铃玲　刘桦　潘克俭　王玉明    

【摘要】  　　目的　研究Survivin反义寡核苷酸对A549细胞增殖和凋亡的影响。方法　针对Survivin mRNA序列设计了反义寡核甘酸，转染A549细胞，PT-PCR检测细胞中survivin基因的mRNA含量；Western印迹显示Survivin蛋白水平；以MTT法检测细胞增殖，TUNEL法检测细胞凋亡。结果　Survivin反义寡核苷酸可明显降低A549细胞中survivin的mRNA和蛋白水平。MTT比色法结果说明人Survivin反义寡核苷酸抑制A549细胞增殖，抑制率远高于无义寡核苷酸组和空白对照组。TUNEL法检测结果显示，反义寡核苷酸还显著增强A549细胞对抗肿瘤药高三尖杉酯碱的敏感性，在较低高三尖杉酯碱浓度下，反义寡核苷酸转染细胞的凋亡率明显高于其它对照组。结论　survivin反义寡核苷酸有望应用于肿瘤的辅助之中。

【关键词】  Survivin；反义寡核苷酸；A549细胞；增殖；凋亡

    Abstract：Objective To investigate the effect of survivin antisense oligonucleotide to the proliferation and apoptosis of A549 cells.Methods Designed a human survivin antisense oligonucleotides and transfected it into A549 cells.The expression of survivin mRNA and the level of protein were detected by RT-PCR and Western blot methods respectively.The MTT assay was used to detect the cell proliferation and the apoptotic rates were measured by TUNEL assay.Results The quantity of survivin mRNA and the level of protein were decreased by this antisense oligonucleotide.The antisense oligonucleotides had a inhibitory rate of proliferation which was much higher than the rate of the control.The apoptotic rate obtained by transfecting cells with antisense oligonucleotide was higher than the rate of control which all exposed to the low concentration of homoharringtonine.Conclusion The experiment results indicate that antisense oligonucleotide can deserve as an approach to subservient tumor therapy in future.

    Key words：Survivin;antisense oligonucleotide;A549 cell;proliferation;apoptosis

　　Survivin（存活素）属于凋亡蛋白抑制因子(inhibitor of apoptosis protein,IAP)家族，具有强大的抗细胞凋亡功能，通常以二聚体形式存在，与Caspase二聚体以均称对等方式结合，从而抑制后者活性，进而抑制了细胞凋亡［1］；也可活化CDK4（周期蛋白依赖性激酶4），使细胞进入增殖周期，导致大量细胞无限制生长［2］。在正常生理状态下，Survivin不在终末分化的成人组织表达。但在绝大多数癌组织中表达，而且随着癌前细胞向癌细胞的转化，其表达逐渐升高［3，4］。肿瘤是否发生转移与预后密切相关。正常细胞脱离原来的组织时会启动凋亡过程，导致细胞死亡。研究认为，在恶性肿瘤中，脱落的癌细胞因为Survivin对凋亡的抑制而受到了保护，得以继续存活并分裂增殖，进而进行远离部位的转移，形成肿瘤。从而使病人预后不良［5］。因此认为Survivin的存在代表着正常细胞恶性转化的细胞生物学行为特征。本研究针对Survivin mRNA序列设计了反义寡核苷酸，抑制Survivin蛋白的合成，验证了Survivin反义寡核苷酸能抑制A549细胞增殖，提高细胞对抗肿瘤药物高三尖杉酯碱（homoharringtonine,HHT）的敏感性。

    1　材料与方法

    1.1　试剂和细胞株

    A549肺癌细胞株由四川大学生命院细胞生物学教研室赠送。脂质体LipofectamineTM2000购自Invitrogen公司；MTT(噻唑蓝)购自Santa Cruz公司；兔抗Survivin多克隆抗体购自Santa Cruz公司；逆转录试剂盒购自MBI公司；Tag聚合酶和TRIZOL试剂购自Gibco公司；PVDF膜购自Millipore公司；ECL试剂盒购于博士德公司；细胞凋亡DNA片段原位末端标记(TUNEL)试剂盒购自Boehringer Mannheim公司。高三尖杉酯碱购于四川大学华西药房。

    1.2　反义寡核苷酸

    应用RNA structure 315对人survivin mRNA的二级结构进行了模拟,依此设计并合成了反义寡核苷酸ASODN链和无义链，两端各有5个碱基硫代修饰,由上海生工公司合成。

    反义寡核苷酸序列：5’-CCCAGCCTTCCAGCTCCTTG-3’

    无义寡核苷酸序列：5’-GCCACTCCTCGACTCTCGTG-3’

    1.3　细胞转染

    A649细胞在含10%小牛血清的RPMI 1640培养液，37℃,5%CO2中培养,胰酶消化,计数,分别接种于96孔细胞培养板(每孔细胞6 000个)和6孔板，37℃培养过夜,在LipofectamineTM2 000脂质体介导下进行反义寡核苷酸和无义寡核苷酸的转染,空白对照组孔内加入含相同浓度脂质体的RPMI 1640培养液。6h后移去含脂质体的培养液，换为含10%血清的RPMI 1640培养液继续培养。

    1.4　RT-PCR检测

    TRIZOL法提取6孔板内细胞的总RNA，用紫外分光光度仪定量；各样本取1μg总RNA进行逆转录，取cDNA 5μl/样本，加Survivin PCR引物，同时加入β-actin引物作为内对照，双引物常规PCR反应，25个循环。琼脂糖电泳检测PCR产物。

    1.5　Western印迹检测

    PBS冲洗细胞一次，用含蛋白酶抑制剂的冷NP-40细胞裂解液收获蛋白。将抽提蛋白用Bradford法定量，50μg/泳道进行SDS-PAGE；电泳结束后，以100V，1h将蛋白转移至PVDF膜；封闭液（含0.5%脱脂奶粉)封闭2h，加入一抗(1∶400,V/V)4℃过夜，二抗(1∶1500，V/V)室温下杂交45min，洗膜后用ECL试剂盒进行发光反应，压片、显影、定影，观察蛋白印迹。

    1.6　MTT法检测细胞增殖

    细胞转染后,继续在96孔细胞培养板培养24、48、72h；在以上时段分别加入MTT，测其A490值,具体方法见［6］。分别设未作任何处理的空白组、空脂质体转染组、SODN组、ASODN组；同时将ODN终浓度分别设为200、400、600nmol/L。每组均设8个平行孔(取平均值作为1次实验结果),并重复3次(批)实验。反义寡核苷酸对细胞生长的抑制率=(A反义核酸-A对照)/A对照×100%。于酶标免疫测定仪上测定。

    1.7　反义寡核苷酸与高三尖杉酯碱共同处理细胞

    在6孔板内放置预先处理好的盖玻片，按适当的细胞数接种。当细胞达到适当生长密度时转染寡核苷酸，ODN终浓度为400nmol/L。细胞在转染6h后,换为含0.2mg/L浓度的高三尖杉酯碱的RPMI 1640培养液,继续培养24h后，取出盖玻片，PBS清洗3次，4%多聚甲醛固定。

    1.8　细胞凋亡检测

    用DNA片段原位末端标记(TUNEL)法，检测经反义寡核苷酸（400nmol/L）与高三尖杉酯碱（0.2mg/L）共同处理的细胞，与对照组细胞(无义寡核苷酸转染后，0.2mg/L浓度高三尖杉酯碱处理)凋亡的比率。每组均设6个平行孔，并重复1次。

    1.9　统计学处理

    所有实验数据采用SPSS 11.0统计软件行t检验和方差分析。

    2　结果

    2.1　ASODN对A549细胞Survivin mRNA表达的影响　　RT-PCR检测结果显示,各组细胞均有不同程度特异性Survivin扩增产物条带（347bp），但ASODN组表达均显著弱于SODN对照组和空白对照组(图1)。β-actin内对照产物（183bp）量均一致，表明该序列Survivin的ASODN可诱导survivin mRNA特异性的降解。

    1泳道为ASODN组，2泳道为SODN组，3泳道为空白对照组

    图1　RT－PCR检测ASODN对细胞Survivin mRNA表达的影响

    Fig.1　Antisense oligonucleotides downregulates the expression of mRNA survivin

    2.2　ASODN对A549细胞Survivin蛋白表达的影响　　Western blot检测结果显示，各组细胞均有特异性Survivin蛋白(16.5KD)条带，但ASODN组蛋白表达均明显弱于SODN对照组和空白对照组(图2)，表明该序列ASODN能降低A549细胞内Survivin蛋白的表达。

    1泳道为ASODN组，2泳道为SODN组，3泳道为空白对照组

    图2　Western blot检测ASODN对细胞Survivin蛋白表达的影响

    Fig.2　ASODN decrease the expression of survivin protein

    2.3　ASODN对A549细胞增殖的影响

    在转染48h后,经检测发现，不同浓度Survivin的ASODN与相对应的空白组、空脂质体转染组、SODN组相比，对SMMC-7721细胞的生长有明显抑制作用（ASODN组与各组相比较，P＜0.01）；400nmol/L浓度的ASODN抑制率（40.23±2.64%）明显高于200nmol/L组（26.73±1.78%）（Ｐ＜0.01），而与600nmol/L组（41.04±2.92%）没有明显差异（Ｐ＞0.05）；（图3）。空脂质体转染组细胞的生长有较小的抑制(4.17±0.23%)，可能是脂质体对细胞有一定的毒性。

    图3　Survivin反义寡核苷酸对A549细胞增殖的抑制

    Fig.3　Antisense oligonucleotides inhibit the proliferation of A549 cells

    2.4　ASODN对高三尖杉酯碱诱导A549细胞凋亡的影响　　TUNEL法检测ASODN和高三尖杉酯碱共同处理的细胞的凋亡，发现ASODN对高三尖杉酯碱诱导SMMC-7 721细胞凋亡有显著作用，ASDON组的凋亡率（31.85±4.56%）明显高于对照组(16.14±2.12%)（Ｐ＜0.01），显示ASODN提高了细胞对高三尖杉酯碱的敏感性（图4）。

    图4　ASODN和高三尖杉酯碱共同诱导的A549细胞凋亡率

    Fig.4　Apoptotic rate of A549 cells induced by ASODN and HHT

    3　讨论

    IAP家族是一类进化过程中高度保守的凋亡抑制蛋白,在体外能够直接抑制细胞凋亡下游终端效应器Caspase-3和Caspase-7。与IAP家族的其它蛋白不同，Survivin对细胞凋亡和细胞分裂周期具有双重调控作用。用免疫组化法检测60个肿瘤细胞株的Survivin水平,发现均有不同程度表达。这一普遍分布现象显示Survivin基因在癌症中可能处于失控的表达状态。Survivin的组织分布特征具有明显的细胞选择性，除胎盘和胸腺组织中有微弱的表达外，在其它正常组织中都检测不到，而Survivin在胚胎发育时期曾广泛分布于不同的胚胎组织，表明Survivin基因的表达在人类发育过程中起着某些重要的作用［7］。Survivin在绝大多数肿瘤组织以及约50%高分化的非霍奇金氏淋巴瘤中表达，且其高表达常与预后不良相关。

    Survivin在许多肿瘤表达的普遍性，使得应用Survivin的阻断性抗体免疫或基因治疗促进肿瘤细胞凋亡的抗肿瘤疗法成为可能。第一，Survivin在多数肿瘤中高表达或普遍表达，而在相应正常组织中低表达或不表达，使靶向治疗具有较好的特异性；第二，Survivin在细胞中呈周期依赖性表达，靶向治疗能在周期中相应的阶段增加化疗、放疗的药敏性,促进癌细胞的凋亡。目前,国内外已有多篇报道证实,用反义寡核苷酸影响Survivin基因的表达可抑制细胞增殖并诱发凋亡。

    本实验应用软件对人Survivin mRNA的二级结构进行了模拟，依此设计并合成了反义寡核苷酸ASODN链，RT-PCR和Western印迹结果显示，该Survivin反义寡核苷酸转染A549细胞后,细胞内Survivin的mRNA及蛋白水平均有显著下降,作为对照的反义寡核苷酸序列则不能降低细胞内Survivin的表达。同时MTT实验显示survivin反义寡核苷酸能有效抑制A549细胞的增殖，抑制率明显高于无义寡核苷酸和空白质粒组。说明在降低细胞Survivin基因的表达后，肿瘤细胞的增殖能力被有效抑制，提示以Survivin基因为目标的靶向治疗是可行的。

    高三尖杉酯碱(Homoharringtonine,HHT)是从特有的三尖杉植物中分离出的生物碱，可干扰核蛋白体功能，通过使核蛋白体分解，释放出新生肽链来抑制蛋白合成的起始。已发现其可抑制多种肿瘤细胞生长增殖,诱导其细胞凋亡。目前高三尖杉酯碱已被列为抗肿瘤药物。实验结果也表明，在相同浓度的高三尖杉酯碱下，反义寡核苷酸转染的细胞凋亡率明显高于对照组细胞。说明细胞Survivin基因的表达降低后，其抗凋亡的能力被有效的抑制了。Survivin反义核酸能加强HHT诱导癌细胞凋亡，其意义在于一方面能够减少HHT的药物临床用量,减轻毒副作用;另一方面,又加强了治疗作用,使它的应用更加安全有效。

    实验结果显示Survivin靶向抑制可望应用于某些Survivin高表达肿瘤的特异性治疗。

【】
  ［1］Ambrosini G,Adida C,Altieri D.A Novel Antiapoptosisgene,Survivin,Expressed in Cancer and Lymphoma［J］.Nat Med,1997,3:917-921.

［2］Suzuki A,Ito T,Kowano H,et al.Survivin Initiates Procaspase3/p21 Complex For- mation as a Result of Interaction with CDK4 to Resist Fas Mediated Cell Death［J］.Oncogene,2000,19(10):1 346-1 353.

［3］Sarela AI,Macadam RC.Expression of the Antiapoptasis Gene,Survivin,Predicts Death from Recurrent Colorectal Carcinoma［J］.Gut,2000,46:645-650.

［4］Ashraful I,Jajime K,Nalyuki T,et al.High Expression of Survivin,Mapped to 17q25,Is Significantly Associated with Poor Prognostic Factors and Promotes Cell Survival in Human Neuroblastoma［J］.Oncogene,2000,19:617-623.

［5］Verdecia MA,Huang H,Dutil E,et al.Structure of the Human Antiapoptotic Protein Survivin Reveals Adimeric Arrangement［J］.Nat Struct Biol,2000,7:602-608.

［6］司徒镇强,吴军正.细胞培养［M］.西安:世界图书出版社,1996:186-187.

［7］Olie R A,Simoes2Wust P,Baumann B,et al.A Novel Antisense Oligonucleotide Targeting Survivin Expression Induced Apoptosis and Sensitizes Lung Cancer Cells to Chemotherapy［J］.Cancer Res,2000,60(6):2 805-2 809.