Pythium sp.GY1938菌株类枯草菌素蛋白酶Pr1基因的克隆与序列分析

【摘要】  　　目的 克隆Pythium sp.GY1938菌株类枯草菌素蛋白酶Pr1基因。方法 在已经克隆得到的Pythium sp.GY1938菌株类枯草菌素蛋白酶cDNA片段的基础上，首先通过PCR扩增得到与其相对应的基因组DNA片段，然后分别通过Mini基因组DNA文库法和Panhandle PCR法扩增其上游和下游未知片段，最后通过PCR法扩增得到类枯草菌素蛋白酶基因片段。结果 克隆得到1 519bp Pr1蛋白酶基因序列YP1977，DNAassist软件分析其中含有一个969bp的完整的开放阅读框，编码323个氨基酸，NCBI BlastX比对结果显示，该阅读框可能编码的氨基酸序列与多个物种的Pr1蛋白酶都具有较高的同源性。结论 YP1977很可能是Pythium sp.GY1938菌株类枯草菌素蛋白酶Pr1基因的部分片段，但仍需要进一步通过构建表达系统加以验证。

【关键词】  类枯草菌素蛋白酶；克隆；基因组文库；锅柄聚合酶链式反应

　　Cloning and Sequence Analysis of Subtilisin-like Protease Pr1 Gene from Pythium sp.GY1938

    Abstract：Objective To obtain the full-length genomic DNA sequence of the subtilisin-like protease(Pr1)gene from Pythium sp. GY1938.Methods Basing on the obtained cDNA sequence of the Pr1 from Pythium sp.GY1938,a genomic DNA fragment corresponding to the cDNA was amplified by PCR firstly.Then the upstream and downstream unknown fragments were respectively cloned by mini genomic DNA library and panhandle PCR methods.In the end,the gene fragment of the Pr1 was amplified by PCR.Results A 1 519bp DNA fragment called YP1977,in which there is a 969bp ORF coding 323 amino acids analysed by DNAassist software,of subtilisin-like protease gene from Pythium sp.GY1938 was obtained.Conclusion The fragment,YP1977,is the Pr1 gene from Pythium sp.GY1938 in all probability.However,it must be validated further by the construction of expression system.

    Key words:Subtilisin-like protease；clone；genomic DNA library；panhandle PCR

      蚊虫是世界性害虫，能够通过叮咬、吸血在人际间传播多种烈性传染性疾病，如疟疾、登革热等，给人类的日常生活和健康带来严重的负面影响［1］。但是，由于菊酯等化学杀蚊剂的长期滥用，使得3R(再猖獗Resurgence、抗药性resistance和残毒residue)问题日益严重［2-3］。近年来，随着对有害昆虫进行生物综合防治的观念的推广，一种在界中能主动致病蚊虫、控制蚊虫群体的病原真菌——Pythium sp.GY1938菌株作为蚊虫生物防治的新生力量正逐渐引起人们的重视和应用［4］。Pythium sp.GY1938菌株是由贵阳医学院苏晓庆教授等分离得到的一株具有自主知识产权的高效特异杀灭蚊幼虫——孑孓的水生丝状真菌，可以有效切断经蚊虫传播疾病的途径，在蚊虫防治和保护人类身心健康中起着十分重要的作用［5］。通过研究发现，与其它昆虫病原真菌一样，Pythium sp.GY1938菌株在侵染孑孓体壁过程中也会分泌蛋白酶、几丁质酶和脂酶等水解酶［6］。这些水解酶和机械压力共同作用，促进菌丝刺穿孑孓坚硬的体壁，是孑孓的主要致病因素之一［7］。因此，克隆Pythium sp.GY1938菌株侵染孑孓体壁的重要致病基因将会为研究其致病机制，通过基因工程技术改造菌株、提高菌株毒力奠定基础。

    1  材料和方法

    1.1  菌株

    Pythium sp.GY1938菌株由贵阳医学院生物防治课题组分离保存。

    1.2  基因组DNA的提取成都医学院学报

    J．C  D  M  C 2006.1.1          杨  平，等.Pythium sp.GY1938菌株类枯草菌素蛋白酶Pr1基因的克隆与序列分析

    成都医学院学报

    JOURNAL  OF CHENGDU  MEDICAL  COLLEGE 2006年第1卷第1期

    采用氯化苄法提取基因组DNA，具体步骤参照［8］。

    1.3  Pr1基因GYPR1-1片段的克隆

    根据MOPAC法已经克隆得到的cDNA片段设计引物，以Pythium sp.GY1938菌株基因组DNA为模板进行PCR扩增反应，扩增引物为A1（CTG GCC ATC CTG GTG CCG TCG）和A2（GGG CAT GGG ACA CAC GTG AT），反应程序为：95℃变性，5min；35轮循环（94℃，45s；58℃，1min；72℃，1min）；72℃延伸，10min；4℃保存。具体步骤详见文献［10］。

    1.4  Mini基因组文库法克隆GYPR1-1上游GYGL-1片段    具体步骤详见文献［9］。

    1.5  Panhandle PCR法克隆GYPR1-1下游GYPHP34片段    具体步骤详见文献［10］。

    1.6  Pr1基因YP1977的克隆

    以Pythium sp.GY1938菌株基因组DNA为模板进行PCR扩增反应，扩增引物为V1（ACC CAT CGT CGG CAC ACA ACG GCA C）和V2（CAG TAG GCA ACA GAC AGG TGA GCA A），反应程序为：95℃变性，4min；35轮循环（94℃，45s；60℃，1min；72℃，1min）；72℃延伸，10min；4℃保存。

    2  结果与分析

    2.1  Pr1基因GYPR1-1片段的克隆

    根据苏晓庆等采用MOPAC法克隆得到的Pr1蛋白酶部分cDNA序列设计引物A1和A2，以基因组DNA为模板，PCR法扩增得到一条530bp大小的PCR产物，命名为GYPR1-1。根据序列分析表明，GYPR1-1与已知的cDNA序列完全吻合，证明该部分基因组序列全部由外显子组成。

    2.2  GYPR1-1上游GYGL-1片段的克隆

    采用Mini基因组文库法克隆GYPR1-1上游GYGL-1片段，克隆得到的GYGL-1长度为780bp，其中含有117bp载体pBluescript sk(-)上的序列和362bp GYPR1-1的序列，以及301bp Pr1蛋白酶基因上游未知序列。具体数据详见文献［9］。

    2.3  GYPR1-1下游GYPHP34片段的克隆

    采用Panhandle PCR法克隆GYPR1-1下游GYPHP34片段，克隆得到的GYPHP34长度为876bp；经过序列分析和NCBI Blastn程序比对，结果显示，本次PCR扩增产物GYPHP34含有 Pr1蛋白酶基因下游853bp的未知序列。具体数据详见文献［10］。

    2.4  Pr1基因YP1977的克隆

    根据上述克隆得到Pythium sp.GY1938菌株Pr1蛋白酶的GYGL-1和GYPHP34 基因片段的序列，分别设计了2条引物V1和V2，克隆得到大小为1 519bp的Pythium sp.GY1938菌株Pr1蛋白酶基因片段YP1977，经过序列分析和NCBI Blastn比对，表明其中包括530bp的GYPR1-1和应用mini基因组文库法获得的上游242bp未知序列以及采用锅柄PCR法克隆得到的下游747bp未知片段。由于GYPR1-1基因片段与其对应的cDNA序列完全一致，所以基因片段GYPR1-1完全是由外显子组成，其两端序列分别编码了Pr1蛋白酶保守序列（N端：G H G T H V，C端：G T S M A T P），同时，Genebank资料整理表明，该保守序列两侧300bp内不含有内含子，所以可以根据这段外显子序列在一定范围内向上游寻找起始密码子，向下游寻找终止密码子。同时，借助机辅助软件DNAssist对YP1977基因片段进行序列分析，在第230位至1119位核苷酸之间确定了一个完整的开放阅读框，长969bp，编码323个氨基酸，推测分子量为33kD,等电点为pI 5.1。NCBI BlastX比对结果显示，该基因可能编码的氨基酸序列与多个物种的Pr1蛋白酶具有较高的同源性，其中与Aphanomyces astaci比对，score bits=45%,E value=2e-42,i?dentity=213；与Chloroflexus aurantiacus比对score图1  PCR产物YP1977核酸序列及预测氨基酸序列分析

    Fig.1  The nucleotide sequence of YP1977 and deduced amino acid sequence.

    框内序列为DNAassist软件预测的起始密码子(ATG)和终止密码子(TAG)；下划线表示本研究最初获得的Pythium sp.GY1938菌株Pr1基因片段GYPR1-1，其序列及在基因中的位置与本课题组采用MOPAC RT-PCR技术获得的Pythium sp.GY1938菌株Pr1蛋白酶cDNA片断相对应；左侧数字为核苷酸数，右侧为氨基酸数；轻波浪线为Pythium sp.GY1938菌株Pr1蛋白酶N端保守区；重波浪线为Pythium sp.GY1938菌株Pr1蛋白酶C端保守区；黑体序列为引物V1和V2.

    bits=42%,E value=1e-45,identity=185；与Symbiobacterium thermophilum IAM比对score bits=40%,E value=5e-40,identity=167。该开放阅读框仅为软件预测，还需要进一步确证。具体序列如图1所示。

    3  讨论

    与昆虫体壁成分相对应，昆虫病原真菌在侵染昆虫体壁过程中主要分泌蛋白酶、几丁质酶和脂酶等水解酶［11］，它们与机械压力协同作用，共同决定了病原真菌穿透昆虫体壁的速度，即击倒害虫时间的长短［12］。Charnley和Leger等人对金龟子绿僵菌侵染昆虫体壁过程进行了较为详细的研究，认为类枯草菌素蛋白酶即Prl在侵染过程中起重要作用。Leger等将Pr1基因导入金龟子绿僵菌，使之高效表达，得到了毒力大幅度提高的改良菌株［13］。

    Pythium sp.GY1938是一种重要的杀灭孑孓的水生丝状真菌，它生命力旺盛，抗逆能力强，可以耐寒越冬，高效，安全，特异性强，在我国乃至全世界蚊害严重的地区都有广阔的应用空间。研究发现，在昆虫体壁类似物的诱导条件下Pythium sp.GY1938菌株也可以分泌Pr1蛋白酶，并且，随着Pr1蛋白酶分泌量的增加，菌株的致病毒力也有增强，证明该酶与本菌株毒力密切相关［14］。

    为了从分子水平研究Pythium sp.GY1938菌株的致病机理，作者对该菌株Pr1蛋白酶基因进行了相关的克隆研究。最初，通过对多物种Pr1蛋白酶氨基酸序列进行同源比对，根据保守序列设计一套简并引物，采用RT-PCR和MOPAC技术克隆得到530bp的Pr1蛋白酶cDNA片段［15］。随后，分别采用构建cDNA文库和RACE技术扩增Pr1蛋白酶全长cDNA,但是这两种方法均未获得成功。于是，只好放弃了上述两种方法，根据获得的cDNA序列首先通过PCR技术克隆得到部分基因组片段，然后，分别采用两种简单易行的克隆已知序列两侧未知序列的技术——mini基因组DNA文库筛选法［9］和panhandle PCR法［10］克隆该基因片段上游和下游未知序列，并根据上游和下游序列设计引物，最终克隆得到长度为1 519bp的Pr1基因片段。由于本研究得到的这1 519bp片段为基因组DNA，因此无法准确确定其中外显子的分布，只能通过DNA序列分析软件DNAassist和生物信息学比对进行初步分析。至于该片段是否为Pr1基因以及该片段结构基因中外显子和内含子的具体分布情况，这些都有待于进一步通过cDNA的克隆和构建表达系统来加以验证。

    此外，基于本研究目前所获得的基因序列信息和研究经验，正在进一步克隆该Pr1基因上游和下游未知序列，旨在最终克隆得到该基因的全部结构基因和上下游转录调控序列。从而利用Pythium sp. GY1938菌株固有的调控序列和结构基因，通过构建Pr1蛋白酶基因超表达重组载体，利用转基因技术改造菌株，提高菌株毒力；或通过构建RNAi重组载体，在转录后水平破坏掉Pr1基因的表达，以此来进一步研究Pr1基因的致病机理。

【】
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