HPLC法测定清热润通胶囊中大黄素及大黄酚的含量

【摘要】  目的：测定清热润通胶囊中大黄素及大黄酚的含量。方法：采用高效液相法，色谱柱为YWG C18 柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；甲醇－0.1%磷酸溶液（85∶15）为流动相；柱温25 ℃，检测波长为254 nm，流速为1.0 mL/min。结果：大黄素的线性范围为22.9 μg～183.2 μg，大黄酚的线性范围为20.1 μg～160.8 μg；平均加样回收率，大黄素为97.92％，RSD=1.75％（n=5），大黄酚为97.62％，RSD=1.18％（n=5）。结论：该方法简便、快速、准确，可用于清热润通胶囊的质量控制。

【关键词】  清热润通胶囊 大黄素 大黄酚 HPLC 含量测定

    Abstract   Objective：To establish a HPLC method for determination the contents of emodin and chrysophanol in Qingre Runtong capsule. Methods：HPLC was performed on YWG-C18（250 mm×4.6 mm，10 μm）column with methanol-0.1% phosphoric acid（85∶15）as mobile phase at flow rate of 1.0 mL/min. The column temperature was 25 ℃ and the detection wavelength was 254 nm. Results：The liner ranges of emodin and chrysophanol were 22.9 μg～183.2 μg and 20.1 μg～160.8 μg. The average recovery rate of emodin was 97.92%（RSD=1.75%，n=5）and that of chrysophanol was 97.62%（RSD=1.18%，n=5）. Conclusion：This method is simple，quick，accurate，which can be used for the quality control of Qingre Runtong capsule.

    Key word   Qiangre Runtong capsule; emodin; chrysophanol; HPLC; quantitative determination

    清热润通胶囊是由大黄、牡丹皮、当归、枳实等多味中药制成的复方制剂，具有清热除湿、润肠通便的功效，临床上用于大肠湿热所致的便秘、牙龈肿痛、口舌生疮等病证。该制剂在制定质量标准过程中，建立了高效液相法测定其中大黄素及大黄酚含量的方法［1］。通过测定大黄素及大黄酚含量，能够有效地控制该制剂的内在质量，从而保证临床疗效的稳定，现将测定结果报道如下。

    1   实验材料

    1.1   实验仪器

    Agilent 1100 高效液相色谱仪，包括AgilentG1311A四元泵（Quatpump）、Agilent G1322A真空在线脱气机（Degrasser）、Agilent G1313A自动进样器（ALS）、Agilent G1315B DAD二极管阵列检测器、Agilent chimstation system（安捷伦化学工作站）、YWG C18 （250 mm×4.6 mm，5 μm）；天平（德国赛多利斯BP211D）；超声提取器（上海分析仪器设备厂生产）；Milipore－Q纯水器。

    1.2   药品与试剂

    大黄素（批号：110756-200110，20 mg）、大黄酚（批号：110796-200311，20 mg）由药品生物制品检定所提供；清热润通胶囊（批号：060308，山西省中医药研究院制剂中心提供）；甲醇（HPLC级，天津四友提供），其他试剂均为分析纯。

    2   实验方法

    2.1   色谱条件

    色谱柱为YWG C18 （250 mm×4.6 mm，5 μm）；流动相：甲醇－0.1%磷酸溶液（85∶15)；流速为1.0 mL/min，检测波长为254 nm，柱温为25 ℃。

    2.2   对照品溶液的制备

    精密称取适量大黄素对照品、大黄酚对照品，加甲醇制成每1 mL含大黄素9.16 μg、大黄酚8.02 μg的混合对照品溶液。

    2.3   供试品溶液的制备

    精密称定清热润通胶囊的内容物约2 g，研细，加甲醇30 mL，称定重量，加热回流提取1 h，放冷，再称定重量，用甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过。精密量取续滤液10 mL，置烧瓶中，挥去溶剂，加8％盐酸溶液10 mL，超声处理（功率250 W，频率33 kHz）2 min，再加三氯甲烷15 mL，于水浴上加热回流1 h，立即冷却，置分液漏斗中，用三氯甲烷提取3次，每次15 mL，合并三氯甲烷提取液，减压回收溶剂至干，残渣加适量甲醇溶解，并定容于10 mL量瓶中，滤过，取续滤液，作为供试品溶液［2］。

    3   结   果

    3.1   阴性空白试验

    按处方比例和工艺制备缺大黄的阴性空白样品，按供试品溶液的制备方法制备阴性空白样品溶液，测定。结果表明，空白对照品色谱图在与标准品及样品色谱图相同位置上无大黄素及大黄酚的色谱峰，表明处方中其他药味无干扰（结果见图1）。

    3.2   线性考察

    精密吸取大黄素（9.16 μg/mL）及大黄酚（8.02 μg/mL）对照品混合溶液，分别进样2.5 μL、5 μL、10 μL、15 μL、20 μL，对所测得的峰面积（Y）和各对照品进样量（X）作回归处理，得大黄素标准曲线，并得到大黄素回归方程为：Y＝4 419.805X＋2.492，相关系数r＝0.999 92，表明大黄素在0.022 9 μg～0.183 2 μg范围内进样量与峰面积值有良好的线性关系。大黄素线性关系考察峰面积数值见表1。

    另外还得大黄酚标准曲线，并计算得到大黄酚回归方程为：Y＝449 3.147X－1.209，相关系数r＝1.000 00，表明大黄酚在0.020 1 μg～0.160 8 μg范围内进样量与峰面积值有良好的线性关系。大黄酚线性关系考察峰面积数值见表2。

    3.3   精密度试验

    精密吸取大黄素（9.16 μg/mL）及大黄酚（8.02 μg/mL）对照品混合溶液，分别按上述含量测定色谱条件进样5次，测得大黄素精密度为：RSD=0.10％（n=5），大黄酚精密度为：RSD=0.20％（n=5），结果见表3。表明本方法精密度良好。

    3.4   稳定性试验

    取同一供试品溶液，分别于0 h、1 h、2 h、3 h、4 h、5 h、6 h进样测定，记录大黄素峰面积，RSD=1.12％，结果表明供试品溶液在6个小时内保持稳定。

    3.5   重复性考察

    取同一批清热润通胶囊（批号：060308），按上述含量测定色谱条件，测定大黄素及大黄酚含量，方法重复性结果，大黄素：RSD=2.24%（n=5），大黄酚：RSD=1.64%（n=5）为1.64，表明该方法重现性良好。

    3.6   回收率试验

    取已知含量清热润通胶囊内容物5份，每份约2 g，精密称定，分别加入大黄素对照品溶液（0.052 mg/mL）及大黄酚对照品溶液（0.086 mg/mL）各1 mL，按正文成品含量测定项下方法制备供试品溶液，于含量测定色谱条件下测定、计算，大黄素的平均回收率为97.93％（RSD=1.75％），见表4。大黄酚的平均回收率为97.62％（RSD=1.18％），见表5。

    3.7   样品测定

    分别精密吸取对照品溶液和供试品溶液各10 μL。按上述色谱条件测定，计算样品中大黄素及大黄酚含量， 测定结果见表6。

    4   讨   论

    参照药典（2005年版）大黄的含量测定方法及其他报道的色谱条件，采用了高效液相色谱法测定本制剂中大黄素及大黄酚的含量。实验研究表明，柱温控制在20 ℃～28 ℃，大黄酚能与邻近的色谱峰很好地分离，若柱温高于30 ℃，则大黄酚峰与邻近的色谱峰部分粘合在一起，影响含量测定结果。本测定方法同时测定了大黄素及大黄酚的含量，较仅测定大黄素一个有效成分的含量，更能有效地控制产品的质量，同时此方法又快捷、简单方便。

【文献】
  ［1］国家药典委员会.中华人民共和国药典（一部）［M］. 北京：化学出版社，2005：17.

［2］年华，张巧艳. 二仙汤中总黄酮和大黄素、大黄酚的测定［J］. 中草 药，2006，37（2）：221-222.