中药芪红合剂对肺间质纤维化模型大鼠肺组织中TGF-β1表达的影响

【摘要】  目的：探讨中药芪红合剂在肺间质纤维化过程中的作用及其机理。方法：采用气管内注射博来霉素A5建立肺间质纤维化的大鼠模型。将40只Wistar大鼠随机分为4组：假手术组、模型组、泼尼松组、芪红合剂治疗组，每组10只。给各组大鼠灌胃相应的生理盐水或药物，术后15 d处死各组大鼠，取两肺组织，一部分行石蜡包埋切片，HE染色，观察病理改变，另一部分采用ELISA法定量测定TGF-β1。结果：与假手术组比较，模型组大鼠肺组织有明显的纤维化改变，TGF-β1的含量显著升高（P<0.01）；与模型组比较，泼尼松治疗组和芪红合剂治疗组大鼠肺组织中TGF-β1含量显著下降（P<0.01）。结论：中药芪红合剂可能通过降低肺组织中TGF-β1的含量而减轻肺间质损伤及纤维化改变。

【关键词】  芪红合剂 TGF-β1 间质纤维化

    Abstract   Objective：To study the effect of Qihong decoction on rats with pulmonary fibrosis and its mechanism. Methods：Model rats were induced by injecting bleomycin A5 into trachea. 40 Wistar rats were randomized into sham operation control group（given saline），model group（given saline），prednisone treatment group，Qihong decoction treatment group（n=10）. The lung tissues were collected after 15 days treatment. The level of TGF-β1 was measured by ELISA，and the level of fibrosis was observed by HE stain. Results：Compared with sham operation control group，the change of pulmonary fibrosis and the level of TGF-β1 in model group rats were obviously increase（P＜0.01）. Compared with model group，the levels of TGF-β1 in two treatment groups were obviously decreased（P＜0.01）. Conclusion：Qihong decoction can alleviate lung tissue damage and pulmonary fibrosis through down-regulating TGF-β1 expression.

    Key words   Qihong decoction; Transforming Growth Factor-β1; pulmonary fibrosis

    特发性肺纤维化（idiopathic pulmonary fibrosis，IPF）是由弥漫性间质性肺疾病引起、以弥漫性肺泡单位慢性炎症和间质纤维化为主要病理特征的一大疾病［1］。该病发病率约为5/10万人，近年来有上升趋势。统计资料显示其5年生存率低于50％，目前临床治疗常用的药物是糖皮质激素、免疫抑制剂和一些抗纤维化制剂，这些治疗尚不能使患者的生存率有所改善。

    中药制剂芪红合剂是我们在临床上治疗各种肺脏疾病的基础方剂，常与他药配用治疗各种慢性肺脏疾病。经临床观察，他能有效保护慢性肺病患者的肺功能，延缓肺病的。在长期临床实践的基础上，我们通过气管内注射博来霉素A5建立肺间质纤维化的大鼠模型，以芪红合剂进行干预治疗，观察致纤维化因子TGF-β1在肺组织的表达，旨在探讨芪红合剂能否有效保护受损肺组织及其可能的作用机制，以明确芪红合剂的抗纤维化功效。

    1   材料与方法

    1.1   实验材料

    1.1.1   实验动物   选用健康雄性Wistar大鼠40只（由山西医科大学实验动物中心提供，二级），体重（200±20）g。

    1.1.2   实验仪器   酶标比色仪（美国宝特公司生产，ELX800型）；石蜡切片机（德国Leica公司生产）；超声波细胞粉碎机（宁波新芝科器研究所生产）；恒温孵育箱（Hirasawa公司生产）；光学显微镜（日本Olympus公司生产）；全自动照相系统（日本Olympus公司生产）。

    1.1.3   药品与试剂   中药芪红合剂由黄芪、红花、大黄、地龙等组成，上药按比例称取后，煎制浓缩为含生药4.4 g/mL的合剂（山西医科大学第二中药制剂室制备）。泼尼松片：5 mg/片，批号：060423，浙江仙琚制药有限公司生产。博来霉素A5：8 mg/支，批号：060401，天津太河制药有限公司生产。大鼠TGF-β1酶联免疫吸附法（ELISA）检测试剂盒（通用型），购自上海轩昊科技发展有限公司；HE染色剂（由山西医科大学医学实验中心新鲜配制）； 10％水合氯醛（山西医科大学生理实验室新鲜配制）。

    1.2   实验方法

    1.2.1   动物分组   40只Wistar大鼠常规适应性饲养3 d，将大鼠随机分为4组：假手术组、模型组、泼尼松治疗组、芪红合剂治疗组，每组10只。

    1.2.2   造模及给药   根据［2］制备肺间质纤维化大鼠模型，气管内注射5 mg/kg博来霉素A5溶液建立肺纤维化动物模型。假手术组动物在同样麻醉条件下气管内注入0.2 mL生理盐水。术后第2天开始每天给大鼠灌胃给药，假手术组和模型组予2 mL生理盐水；沷尼松治疗组予30 mg/kg泼尼松片；芪红合剂治疗组予2 mL中药芪红合剂（用药剂量相当于成人每天每公斤体重的20倍）。

    1.2.3   标本采集   术后15 d处死所有大鼠采集标本。以10%水合氯醛0.3 mL/100 g体重腹腔注射麻醉大鼠，剖取两肺，剪除气管、主支气管，将右肺组织用冰盐水冲洗3遍，滤纸吸干水分，-70 °C冻存，待做肺组织匀浆，用于蛋白指标检测；左肺组织用10％的中性甲醛溶液固定，石蜡包埋切片，以4 μm石蜡切片，常规行HE染色，待做病理形态学观察。

    1.2.4   指标观察

    1.2.4.1   肺组织病理观察   将HE染色后的石蜡切片置于光镜下观察肺组织病理变化。

    1.2.4.2   肺组织TGF-β1检测   采用酶联免疫吸附法（ELISA）进行测定，取右侧肺组织，常温下解冻，吸去血迹，称取300 mg相同部位组织，分别装入EP管，加入PBS液1 mL，冰水中用超声波细胞粉碎机做组织匀浆，离心15 min，取上清液，按照试剂盒说明操作。

    1.2.5   统计学处理   所有数据均以均数±标准差（x±s）表示，采用SPSS11.5统计软件分析，多组间采用单因素方差分析。

    2   结   果

    2.1   肺组织病理观察

    肉眼观察结果见图1~图4。假手术组肺组织结构正常，双肺呈粉红色，表面光滑；模型组可见肺组织体积缩小，表面有片状凹凸不平的苍白灶，也有个别灰黑色病灶。沷尼松组、芪红合剂治疗组均有不同程度的苍白灶，但较模型组明显减少。

    肺组织HE染色光镜下观察结果见图5~图8。假手术组肺组织形态学结构无明显改变；模型组肺组织可见明显的肺间质病变，肺泡隔增宽，间质水肿，炎性细胞浸润增多，成纤维细胞和肌成纤维细胞增殖；沷尼松治疗组和芪红合剂治疗组上述病理改变有所减轻，但较假手术组仍明显。

    2.2   肺组织中TGF-β1检测结果

    结果见表1。由表可见，与假手术组比较，其余3组大鼠肺组织中TGF-β1含量显著升高（P<0.01）；与模型组比较，两治疗组TGF-β1含量显著降低（P<0.01）；而两治疗组间比较无显著差异（P＞0.05）。

    3   讨   论

    肺间质纤维化是多种相关和触发性因素参与的慢性肺疾病的共同结局，早期常常表现为肺泡炎，肺泡内有大量炎症细胞浸润，随后在炎症细胞、血小板等分泌的致纤维化因子的作用下，细胞外基质（ECM）成分合成降解失衡，间质胶原增生、沉积，最终导致肺纤维化。

    根据中医理论，结合医学的发病机理，从中西医结合的角度，我们认为肺纤维化时，患者出现的进行性呼吸困难，肺顺应性降低，肺容量减少，通气/血流比例失调和弥散功能障碍，这些表现与中医学中的气虚血瘀、气虚生痰、痰瘀互结，不荣肺络，久而渐致肺络枯萎，痰瘀阻结肺络成毒为害的病机理论相符。因此，临床上我们配用益气活血化瘀、解毒通络的黄芪、红花、大黄等治疗多种肺系疾病，取得了满意疗效。芪红合剂中黄芪扶正顾本，能够抗炎抗病毒，是一种肯定的免疫功能调节剂，还能够抑制血小板聚集，对血小板聚集有一定的解聚作用［3］164。有研究报道，黄芪能抑制人胚肺成纤维细胞表达细胞间黏附分子-1及白介素-6受体，进而减少ECM的合成［4］。红花活血化瘀，可使全血凝固时间延长，研究表明红花所含成分红花黄色素具有抑制血小板聚集和增加纤溶酶活性的作用，如果以胶原诱导血小板聚集，则红花黄色素有明显的拮抗作用［3］164。大黄解毒泻热，多方研究表明他能够通过多种途径对纤维化疾病起一定的防治作用，如保护细胞，减轻组织损伤，抑制ECM产生细胞的增殖，并诱导其凋亡等［5~6］。地龙清热平喘通络，并能“搜剔络邪”；芦根味甘性寒，凉润爽口，清热生津，养阴润肺。综观全方，黄芪以补气之虚、红花以通络之瘀、地龙以平肺之喘、大黄以泻热之毒、芦根以润肺之阴，补通兼施，补中有泻，共促肺之阴阳调和，窍络贯通，其翕辟（呼吸）之力自适均也。

    在本研究中，我们在肉眼直视下将博来霉素A5缓慢注入大鼠气管内制造模型，然后检测了致纤维化因子TGF-β1的表达变化。大鼠肺组织经博来霉素作用15 d后取材，可见明显的肺间质病变。HE染色肺组织学改变显示肺泡隔明显增宽，间质水肿，炎性细胞浸润增多，成纤维细胞和肌成纤维细胞增殖。模型组肺组织中的TGF-β1表达明显增强，此结果与国内外报道一致。而经过药物干预后的两治疗组TGF-β1表达均有所下降，与模型组相比有统计学意义（P<0.01），且中药芪红合剂的作用与泼尼松相比无显著性差异（P>0.05）。这一结果提示中药芪红合剂与泼尼松均能够有效缓解肺纤维化的早期病变进展，而且可能通过抑制TGF-β1在模型大鼠病变早期肺组织中表达的上调来延缓病变的进展。中药芪红合剂能够抑制TGF-β1在博来霉素诱发肺间质纤维化模型大鼠肺组织中表达的上调，推测其抑制TGF-β1表达上调的作用可能是其抗肺间质纤维化的作用机制之一。我们推测，在肺泡损伤、炎症及纤维化过程中进行早期合理的干预可以延缓肺间质纤维化的进展。

【文献】
  ［1］高春芳，陆伦根． 纤维化疾病的基础和临床［M］. 上海：上海技术出版社，2004：439-447.

［2］Snider G L，Hayes J A，Korthy A L. Chronic interstitial pulmonaryfibrosis produced in hamsters by endotracheal bleomycin： pathologyand stereology［J］. Am Rev Respir Dis，1978，117（6）：1 099-1 108.

［3］康永． 中药药［M］. 北京：科学出版社，2001.

［4］王要军，孙自勤，权启镇． 黄芪对人成纤维细胞ICAM-1，CD126表达及合成ECM的影响［J］.临床药理学与治疗学杂志，1999，4（3）：209-210.

［5］张喜平，李宗芳． 大黄素的药理作用研究概况［J］.中国药理学通报，2003，19（8）：851-854.

［6］屈云，姚平，李廷谦． 大黄素对成纤维细胞增殖及细胞周期的影响［J］. 四川大学学报（医学版），2004，35（1）：73-76.