当归加玻璃酸钠关节腔注射对兔膝骨关节炎软骨细胞Bcl?2、Bax表达的影响

                      作者：刘仕良 杨帆 段祥林 易晨阳 

【摘要】  目的：研究当归注射液结合玻璃酸钠注射液关节腔注射对兔膝骨关节炎软骨软骨细胞Bcl?2、Bax表达的影响。方法：健康家兔50只随机分为5组, 正常对照组、模型对照组、当归组、玻璃酸钠组、当归与玻璃酸钠结合组，每组10只，后4组按Hulth方法建立兔膝骨性关节炎的动物模型，术后每周经膝关节穿刺给药1次，连续给药6周后处死、取材，关节软骨作大体及光镜观察，检测软骨细胞Bcl?2(B?cell lymphomas, B淋巴细胞?2蛋白)、Bax（Bcl?2 Associated X protein, B淋巴细胞?2的相关X蛋白）的表达灰度。结果：各药物预防组动物关节软骨的大体观察评分、组织学评分、软骨细胞Bax的表达灰度均低于模型组（均P<0.01），软骨细胞Bcl?2的表达灰度均高于对照组（均P<0.01），当归与玻璃酸钠合用组效果更佳（均P<0.05）。结论：当归注射液和玻璃酸钠注射液关节腔注射对软骨细胞的退变有显著的减缓作用，尤以两者合用时显著。

【关键词】  骨性关节炎； 当归； 玻璃酸钠； 细胞凋亡

骨关节炎（Osteoarthritis，OA）是一种严重危害老年人健康的慢性进行性骨关节病，关节软骨退行性改变是骨关节炎的特征性病理改变。成人或成年动物的软骨一旦发生退变，目前尚无理想的方法使其获得满意的修复以恢复正常的生理功能。故OA的预防尤显重要，玻璃酸钠注射液(sodium hyaluronate，SH)与当归注射液（Angelica，AG）关节内注射均具有防治OA的作用［1，2］，但效果均有限。本实验采用SH与AG结合用膝关节腔内注射，观察其对兔膝骨关节炎软骨细胞Bcl?2、Bax表达的影响，并对相关机制进行探讨。

    1  材料与方法

    1.1  药物、试剂与仪器

    25%当归注射液（武汉大学中南制药厂），SH注射液(25g/2.5l，上海麦迪克医学科技公司)； Bcl?2蛋白、Bax蛋白抗体，SABC、DBA试剂盒（武汉博士德）。765紫外分光光度计(Shimadzu UV120?02)，HPIAS_1000 高清晰度彩色病理图像分析系统（同济千屏）。健康家兔50只，22～30kg，雌雄兼用（武汉大学实验动物中心提供），随机分为5组:正常对照组、模型对照组、当归组、玻璃酸钠组、当归与玻璃酸钠结合组。

    1.2  实验过程及给药方法

    参照［3］方法，建立Hulth兔右膝关节OA模型，术后不固定伤肢，分笼饲养。术后1周开始每周进行右膝关节腔穿刺给药1次，连续给药6周。模型对照组给药量为生理盐水0.3ml/只，当归组给药量为当归0.15ml/只，SH组给药量为0.15ml/只，当归与玻璃酸钠结合组给药量为当归0.15ml加玻璃酸钠0.15ml/只。各组给药体积均以生理盐水或交互配为0.3ml。给药6周后处死动物。

    1.3  取材、处理与检测

    动物处死前经耳缘静脉取3ml，肝素抗凝3000r/min离心取血浆，取血后气栓法处死。将兔空气栓塞致死后，立即切开右膝关节腔，大体观察滑膜软骨的病变。然后取膝前正中部的滑膜组织约200mg，用冰冻的生理盐水冲洗去血液，滤纸试干，放入2ml冰生理盐水中。剪碎滑膜组织块，倒入玻璃匀浆管中冰生理盐水下匀浆，制成10%的组织匀浆，以3000r/min离心10min，取上清液保存于-70℃冰箱。切开右膝关节时，切下右侧胫骨上端外侧平台，常规固定、脱水、包埋、切片（免疫组化切片行多聚赖安酸处理），HE及甲苯胺蓝染色，光镜观察软骨的改变。Bcl?2、Bax蛋白的表达采用免疫组化方法进行检测，方法步骤按照各试剂盒说明进行。图像分析处理：在40倍显微镜下随机选取8个不重叠的视野，测定阳性细胞的灰度值，取每张切片均值作为其测量值。

    1.4   统计学处理

    全部数据经t检验处理，用( ±s)表示，以P<0.05为差异有统计学意义。

    2  实验结果

    2.1  肉眼及手术显微镜下观察

    除模型组9例软骨表面粗糙、失去光泽外，其余动物软骨表面的颜色、光泽、光滑度及关节液的颜色、多少等均未见异常改变。按Mankin's关节软骨大体评分标准［4］评分，模型组与其它各组有显著差别(P<0.01)， 正常组与各药物预防组间比较无明显差异（均P>0.05）。

    2.2  光镜观察HE、甲苯胺兰染色及评分

    模型组切片光镜观察：软骨表面有小裂纹与溃疡，细胞明显增生，大小不一，四层结构紊乱，潮线不清晰或多重，甲苯胺兰染色重度降低；正常组切片光镜观察：软骨表面光滑、完整，细胞排列整齐，四层结构清晰，潮线清晰完整，甲苯胺兰染色基本正常。AG、SH、SH+AG 3组切片光镜观察：软骨表面光滑、完整，细胞排列稍有紊乱，四层结构清晰，潮线清晰完整，甲苯胺兰染色着色正常或轻度降低。按Mankin's标准评分并进行统计（表1），结果显示：与模型组比较时，AG、SH、SH+AG 3个组均降低了Mankin's评分（P<0.05 ，P<0.05，P<0.01），SH+AG治疗组与AG、SH两组有明显差异（均P<0.05）。表1  各组软骨组织mankin's评分 注：与模型组比较，# P<0.05；* P<0.01。

    2.3  免疫组化及图像分析

    切片用DBA染色的阳性结果为软骨细胞胞浆呈棕褐色或棕黄色颗粒，阴性胞浆不着色或仅有背景着色。相对于模型组，AG和SH治疗组软骨细胞Bax表达的灰度值显著降低（P<0.01），Bcl?2表达的灰度值显著增加（P<0.01）；AG和SH两组无明显差别（P>0.05），SH+AG结合组比单纯的AG或SH治疗组效果更显著（均P<0.05），结果见表2。表2  Bcl?2、Bax在各组软骨表达的灰度值

    3  讨论

    关节软骨正常的形态结构及功能是维持关节生理功能的重要因素，本实验通过改变膝关节生物力学状态以诱导关节软骨退变而形成OA，模型对照组的各项指标观察结果显示造模是成功的。

    药理研究证明: 当归注射液是中药当归水煮醇沉后提取的水溶性成分，它可清除氧自由基、抗氧化,可促进巨噬细胞能力,提高免疫功能,还具有改善末梢神经和微循环等功能［5］ 。

    对于OA的发病机制，目前尚未完全研究清楚。一般认为OA的发生与软骨细胞过度凋亡密切相关，并受相关基因调控。Ba蛋白为促凋亡基因蛋白，Bcl?2家族为目前发现的最重要的抗凋亡基因蛋白。Bcl?2蛋白抗凋亡作用与其跨膜蛋白抑制Ca++超载，阻止凋亡基因信号传递或基因产物的诱导及抑制自由基的产生有关［6］。Hara等研究表明 Bcl?2对细胞凋亡的影响与Bcl?2 及Bax之间的比率大小有关，当 Bcl?2高表达时，可形成 Bcl?2?Bax异源二聚体，抑制细胞凋亡。本实验结果显示，AG与SH单独关节腔注射均能较好地抑制Bax的表达而增强Bcl?2的表达，促进了Bcl?2 /Bax比率失调的恢复，从而对关节软骨退变起到了较好的预防效果。

    据此笔者认为SH、AG单独使用或者两者结合使用关节腔注射对OA的关节软骨的退变均有不同的阻滞作用，主要表现在组织形态学、软骨细胞的凋亡程度等方面，均有不同程度的延缓作用；并且SH与AG结合使用表现出显著的协同作用；与SH、AG两组单独使用组相比，SH与AG联合使用组效果更佳（均P<0.05）。

    另外，从病理角度看，软骨细胞赖以生存的细胞外基质异常降解也可能是导致软骨退变的重要原因之一，许多体内外的研究已证明，脂质过氧化反应、细胞凋亡等因素在这一降解过程中起重要作用。脂质过氧化反应可导致软骨基质降解，引起软骨的退变，表现为SOD的活性消耗性下降，MDA含量增高。反之，脂质过氧化反应的恢复也可减缓关节软骨退变的恢复［7，8］。SOD 为超氧阴离子的清除剂,MDA 是脂质过氧化的产物, 两者可作为动态评价OA 治疗效果的客观指标。在本系列实验中, 需进一步深入探讨玻璃酸钠注射液与当归注射液注射后血浆与关节液的SOD活性, MDA的水平。

【】
  1 刘保新,陈廖斌,汪晖. 当归、阿魏酸钠对骨关节炎软骨退变与自由基的影响.武汉大学学报(医学版),2006,27(5):626～628.

2 凌沛学,梁虹,贺艳丽,等. 透明质酸钠在关节疾病中的应用.修复重建外科杂志,2002 ,16(1) :1～4.

3 聂林,张学义,陈国瑞.骨关节炎的实验模型.中华实验外科杂志,1990，7:96～97.

4 Hayami T, Pickarski M, Zhuo Y, et al. Characterization of articular cartilage and subchondral bone changes in the rat anterior cruciate ligament transection and meniscectomized models of osteoarthritis.Bone, 2006，2:234～243.

5 夏泉,张平,李绍平,等. 当归的药理作用研究进展. 时珍国医国药,2004,15:164～166.

6 Kim HA, Lee YJ, Seong SC, et al. Apoptotic chondrocyte death in human osteoarthritis. Rheum, 2000，27(2): 455～462.

7 Regan E,Flannelly J ,Bowler R, et al. Extracellular superoxide dismutase and oxidant damage in osteoarthritis. Arthritis Rheum,2005,11（3）： 479～473；491.

8 Ostalowska A, Birkner E, Wiecha M , et al. Lipid peroxidation and antioxidant enzymes in synovial fluid of patients with primary and secondary osteoarthritis of the knee joint. Osteoarthritis Cartilage，2006,2:139～145.